微生物接種方法之平板劃線分離法介紹

平板劃線分離法:是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環在平板培養基表面，通過分區劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經培養后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。

為方便劃線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有分區劃線法和連續劃線法兩種

分區劃線法是將平板分四區，故又稱四分區劃線法。劃線時每次將平板轉動60~70°劃線，每換一次角度，應將接種環上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線；

另一種連續劃線法是從平板邊緣一點開始，連續作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當中不需灼燒接種環上的菌。

1）連續劃線法

將瓊脂平皿半開蓋倒置于培養箱內至無冷凝水，接種環于酒精燈外焰燒至紅透，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環至紅。

輕輕搖勻待接種試管，左手手心托待接種試管底側部，右手執接種環，右手小指拔下試管塞，于酒精燈附近將接種環伸進試管，稍候，再插入待接接種液中，蘸一下，取滿一環，抽出、燒塞、蓋蓋、放回試管架。或將接種環通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻，然后以無菌操作接種環直接取平板上待分離純化的菌落。

于靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環伸進平皿，將菌種點種在平板邊緣一處，輕輕涂布于瓊脂培養基邊緣，抽出接種環，蓋上平皿蓋，然后將接種環上多余的培養液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環，待接種環冷卻后，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動劃線，接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關上皿蓋。灼燒接種環，待冷卻后放置接種架上。培養皿倒置于適溫的恒溫箱內培養（以免培養過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。培養后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，鏡檢后再接種斜面。

2）分區劃線法

取菌、接種、培養方法與“連續劃線法”相似。

分區劃線法分離時平板分四個區，故又稱四分區劃線法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。為防止第4區內劃線與1、2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120°左右。

先將接種環沾取少量菌在平板1區劃3~5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動60~70°，右手把接種環上多余菌體燒死，將燒紅的接種環在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60~70°，同樣依次在3、4區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，同上法培養，在劃線區觀察單菌落。