技術和方案19酵母DNA流式細胞記數

TE 緩沖液胃蛋白酶溶液SYTOX Green染色緩沖液

1.生長和收集細胞。細胞生長至 5X10⁶ 個/ml，離心收集 10 ml 樣品，并用 5 mlTE 緩沖液洗一次。再次離心收集并懸浮在 1.5 ml 水中。

2.乙醇固定細胞。每份 1.5 ml 樣品中加人 3.5 ml 無水乙醇，使乙醇的終濃度達 70%。

在室溫中放置 1h，如有必要，可在 4°C 放置樣品。

3.洗去乙醇并超聲波處理分散細胞。離心收集細胞并用 5 ml TE 緩沖液洗一次。超聲波處理分散細胞（每次 5~10s，共 3 輪）

4.核酸酶處理細胞。Tris 緩沖液稀釋核酸酶儲存液至 1mg/ml(IX)。離心收集細胞，移去緩沖液并加入 2 ml IX 核酸酶溶液重新懸浮。37°C 振蕩溫育樣品 lh，如有必要可 4°C 過夜。核酸酶消化充分十分關鍵，這一步可以通過在熒光顯微鏡下觀察細胞來檢測。細胞核因染色會非常明亮，而細胞質除線粒體 DNA 之外不會被染色。

5.胃蛋白酶處理細胞。離心收集細胞并用新鮮配制的 1~2 ml 胃蛋白酶溶液懸浮，室溫溫育樣品 5 min。

6.SYTOX Green 染細胞，方法見 Haase 和 Reed(2002)。配制 SYTOX Green 的 TE 緩沖液（pH7.5)，每 2.5 ml 的 50 mmol/LTE 緩沖液中加入 1ul SYTOX Green。每份樣品加入0.5 ml 的 SYTOX Green 的 TE 緩沖液，使 SYTOX Green 終濃度為 1umol/L。