實驗方法原理
微管蛋白溶液在0~4℃是無色透明溶液，當溫度升高，或37℃保溫時，管蛋白聚合生成微管，隨之溶液的濁度增加，吸收度（OD）上升，這可用分光光度計，在 350 nm 波長測得，根據所測得的OD值對保溫時間作圖，繪出“S”型聚合曲線。相反，將已聚合的微管溶液放水浴。亦可以測定其解聚曲線。
實驗材料 動物腦組織
試劑、試劑盒 MESEGTAMgCl2GlycerinDMSO
儀器、耗材 水浴鍋離心機分光光度計
實驗步驟
一、 微管蛋白的制備
1. 試劑及貯備液
（1）MES貯備液（2N（-Morpholino）ethanesulfonic acid）0.5 mol，MES 19.25 g溶于200 ml 雙蒸餾水。
（2）EGTA貯備液[Ethylene-bis（oxyethylenenitrile）] tetraacetic acid] 5 mmol，EGTA 90 mg溶于100 ml 雙蒸餾水，可以用少量1 mol/L NaOH溶液使其完全溶解。
（3）MgCl2貯備液0.1 mol/L。
2. 緩沖液配制
（1）MES緩沖液：用1 mol/L NaOH調pH至6.5，加雙蒸水至400 mL。放4℃保存備用，臨用前加GTP或ATP至1 mmol。
（2）微管聚合緩沖液：用1 mol/L NaOH調pH至6.5，加雙蒸水至50 mL。放4℃保存備用，臨用前加GTP或ATP至1 mmol。
3. 取材
微管在其核細胞普遍存在，但以動物腦組織中含量最豐富。一般取豬腦，牛腦，因其來源方便，價格便宜。也有用兔、雞、大鼠的腦組織以及海膽卵為材料。
4. 操作
（1）取新鮮動物腦組織，剝去腦膜和大血管，剪碎。
（2）用冷MES緩沖液洗1-2次。
（3）以每克腦組織0.5~1 mL 比例，加入MES緩沖液，在4℃條件下，用帶有Teflon碾槌的電動 （或手動）玻璃勻漿器制成勻漿。
（4）4℃離心105 000 g，1 h，取上清。
（5）加入等體積微管聚合緩沖液，置37℃水浴保溫30 min（同時振搖或中途輕輕攪動數次）。
（6）26℃離心，105 000 g，1 h。
（7）取沉淀，加1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀研碎。
（8）將懸液放冰 0.5 h，使沉淀完全溶解。再重復低溫和高溫離心各一次。
（9）經過這樣兩個循環制得的微管蛋白 85%~95%，其余為微管相關蛋白。
（10）測定蛋白含量。用MES緩沖液稀釋至4~5 mg/mL，置液氮中保存備用或再進一步純化。
二、微光蛋白活性的測定
1. MES緩沖液，配制方法同上。
2. ATP（或GTP）溶液100 mmol/L的原液，試驗當天配制，試驗前加入到微管溶液， 終濃度為1 mmol/L。
（1）取出冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖其瓶壁，使之融化。
（2）放入冰浴，用MES緩沖液稀釋到所需要濃度（2~3 mg/ml），加入ATP至1 mmol/L。
（3）從冰浴上馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計350 nm 下調定為“0”點。
（4）然后將比色用37℃水保溫，于不同時間，測其OD 值。
（5）在開始時最好每1~2 min 測定一次，5 min 以后可間隔較長些時間測定。
（6）直到20~30 min止，將比色杯放冰浴，這時已聚合的微管又解聚，可隨時測定其OD值，直到OD值不再下降為止。
（7）以所測得的OD值對保溫時間作圖可以得到一個正“S”型的聚合曲線，和倒“S”型解聚 曲線（圖65-4）可看到，37℃保溫開始1~2 min，是一暫短的潛伏期，然后曲線呈指數上升。
（8）5 min 后達坪值。當將溫度變為0℃時，曲線迅速下降，但解聚曲線末端比起始端的位置稍高, 可能與聚合時形成的少量不能解聚的聚集物有關。
（9）這種聚合曲線表明微管蛋白有較好的活性，而坪值的高低與管蛋白濃度高低成正比（圖65-5）。
（10）上述測定方法如在連有髙低溫水浴和自 動掃描記錄儀的分光光度計上完成，就更簡便，快速，準確。
三、 抗微管藥物的篩選
1. 具體操作
（1）藥物或化合物能溶于水的，用MES緩沖液配成10 mmol/L 的溶液，如不溶于水的可用乙醇、甲醇、DMSO溶解，放冰箱備用。
（2）一般從0.1 mmol/L 濃度開始測定藥物對微管的影響的實驗，如發現有明顯的作用，可以進一步稀釋3~5個濃度進行測量。
（3）如果0.1 mmol/L 時沒有看到明顯作用，則認為該藥對微管作用不強，不必作進一步的測定。
（4）具體試驗方法，步驟同前（微管蛋白聚合活性的測定）。
2. 結果判斷及計算
（1）抑制微管聚合作用的藥物舉例：秋水仙堿（圖65-6）。抑制率計箅，取37℃保溫 20 min 時，各管的“OD”按以下公式計箅:
（2）促進聚合，抑制解聚的藥物舉例：紫杉醇（圖65-7）。由圖65-7看出，加藥后。
①潛伏期縮短，甚至消失。
②聚合曲線的形狀較對照有明顯改變。
③在改 變溫度至0?4冗時，微管不能完全解聚。
由以上變化不難判定該藥對微管有明顯的影響。
注意事項
1. 在制備微管蛋白的實驗中，一定注意取材要新鮮，爭取在處死動物后1 h 內開始實驗。不能用低溫冷凍后的腦組織，否則收率不高，活性低。
2. 所有器皿要清潔，避免鈣離子污染。
3. 組織勻漿過程中，盡量避免過多泡沫產生，減少蛋白變性。
4. pH對微管體外聚合影響較大，在藥物篩選時，注意藥液的pH不能過高或太低，盡量使加入藥液后，微管蛋白溶液pH不發生明顯改變。
5. 取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖洗瓶壁，使融化，放入冰浴，用冷MES緩沖液（不含GTP或 ATP）稀釋至所需濃度（2~3 mg/ml），加入GTP 或 ATP至1.0 mmol/L 。
6. 以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度350 nm 處調定為“0”點。
7. 比色杯在37℃中保溫，取不同時間測OD值。（每1~2 min 測定一次，5 min 后可延長測定間隔），直至20~30 min 為止。
8. 比色杯放入冰浴中，可隨時測定其OD值，直至OD值不再下降。