方案17原位SDSPAGE肽譜作圖方法（Cleveland法）

含有已分離蛋白質的聚丙烯酰胺平板凝膠

化學切割劑考馬斯亮藍含1mol L Tris-Cl 的乙醇聚丙烯酰胺平板凝膠蛋白酶消化緩沖液蛋白酶溶液

白光盒和手術刀聚丙烯試管平板凝膠電泳儀SpeedVac 濃縮器

方法 1: 酶催化的蛋白質片段化

1.固定聚丙烯酰胺凝膠中分離的蛋白質，用考馬斯亮藍染色（5~lOmin)，然后脫色。

如果蛋白質條帶太淺，重復染色和脫色的步驟，或延長染色時間。

2.將凝膠放入透明的盒子中，用手術刀切下蛋白質條帶，把條帶分別放入聚丙烯試管中。

3.用 10 ml 含有 1 mol/L Tris-Cl 的乙醇，浸泡切下來的含有對照蛋白點的凝膠條帶，室溫 30 min，使凝膠收縮。

這一步有助于切下來的膠進入第二塊平板膠。如果肽譜作圖時著色太淺，應縮短浸泡時間。

4.將凝膠帶切成碎片，把它們放到第二塊平板膠的不同的上樣孔中，第二塊凝膠應是長的（5 cm) 濃縮膠。用干凈的匙引導碎片落到孔的底部。

5.在碎片膠的周圍，用注射器注射蛋白酶消化緩沖液。

6.在每個樣品上方覆蓋 10ul 的蛋白酶溶液。

用足夠的蛋白酶以完成消化。最初試著用酶：底物為 1:50 的比例。

7.電泳，直到溴酚藍到達濃縮膠的底部。

8.關掉電源 20~30 min，使蛋白酶消化蛋白樣品。

9.繼續電泳，直到溴酚蓽到達平板膠的底部。

10.用考馬斯亮藍染色或銀染（見方案 9 或方案 11)，使蛋白質顯色；或用放射自顯影術或熒光攝影術檢測放射性標記的蛋白質。

方法 2: 化學方法使蛋白質片段化

1.固定凝膠，考馬斯亮藍染色（5~10min)，然后脫色。

如果蛋白條帶太淺，重復染色和脫色的步驟，或延長染色時間。

2.將凝膠放人透明的盒子中，用手術刀切下蛋白質條帶，把條帶分別放人 1.5 ml 聚丙烯試管中。

3.用 SpeedVac 濃縮器（或其他設備，如吹風機）使切下來的凝膠干燥。

4.加入約 10ul 化學斷裂試劑（1mg/ml)，直接倒在干燥的凝膠片上，再加入 90W 斷裂試劑。

5.將混合物孵育一定的時間（關于孵育條件，見方案 6、方案 7 或方案 8)。

6.仔細吸出含有肽段的上清液。

7.用 SpeedVac 干燥樣品，加入 50ul 水，再次干燥樣品。

8.重復水洗和干燥過程，2 次。

9.加入 10~30ul SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸樣品 5 min。

10.把上述樣品加到 SDS-PAGE 凝膠中，電泳，直到溴酚藍到達平板膠的底部。

11.用考馬斯亮藍染色或銀染（見方案 9 或方案 11)，使蛋白質顯現。或者，用放射自顯影術或熒光攝影術檢測放射性標記的蛋白質。