曹雪濤課題組：m6A介導的細胞代謝重編程抑制病毒感染

　　病毒感染可以調節宿主細胞的代謝，從而影響病毒的存活或清除。RNA修飾，特別是最為常見的哺乳動物mRNA修飾---N6-甲基腺苷（m6A）---能夠調節基因表達和病毒感染。比如，m6A甲基轉移酶復合物組分METTL3/14限制寨卡病毒產生，而m6A去甲基酶ALKBH5和FTO增強這種病毒的產生。在病毒和宿主之間的相互作用中，由m6A修飾介導的細胞代謝重編程尚不清楚。

　　在一項新的研究中，為了探究mRNA修飾m6A在宿主對病毒感染作出的反應中的作用，來自中國北京協和醫學院、南開大學、西湖大學、中國醫學科學院基礎醫學研究所和第二軍醫大學的研究人員檢測了受病毒感染的宿主細胞中的m6A水平。在小鼠原代腹膜巨噬細胞遭受RNA病毒VSV（vesicular stomatitis virus, 水皰性口炎病毒）感染期間，總RNA中的m6A水平先開始升高，隨后下降，并且伴隨著病毒載量的上升和隨后下降。他們接著對m6A甲基轉移酶復合物（METTL3、METTL14和WTAP）和m6A去甲基酶（ALKBH5和FTO）進行了RNAi介導的功能性篩選，結果發現敲低ALKBH5最大程度地降低VSV RNA水平，隨后利用4種獨立的siRNA對這一點進行了驗證。當遭受表達重組GFP（綠色熒光蛋白）的VSV病毒（下稱GFP-VSV）感染時，小鼠巨噬細胞系RAW264.7中通過CRISPR-Cas9實現的ALKBH5敲除也降低了細胞內病毒的產生。相關研究結果發表在2019年9月13日的Science期刊上，論文標題為“N6-methyladenosine RNA modification–mediated cellular metabolism rewiring inhibits viral replication”。論文通訊作者為曹雪濤（Xuetao Cao）院士。

　　一旦在體外遭受VSV感染，相比于野生型的同窩小鼠，源自ALKBH5缺陷小鼠（即缺乏ALKBH5的小鼠）的腹膜巨噬細胞具有較少的VSV RNA水平和下降的病毒滴度，并且還表現出下降的細胞內GFP-VSV水平。反過來，ALKBH5過表達增加了VSV RNA水平。此外，其他類型的小鼠細胞中的ALKBH5缺乏也抑制了VSV感染，包括骨髓來源的巨噬細胞、原代小鼠胚胎成纖維細胞和肺泡上皮細胞。ALKBH5在人類和小鼠之間高度保守。這些研究人員發現敲低ALKBH5會抑制人THP-1細胞中的病毒感染。ALKBH5缺乏也讓這些細胞抵抗其他類型的RNA或DNA病毒感染，包括RNA病毒腦心肌炎病毒（EMCV）和DNA病毒單純皰疹病毒1型（HSV-1）。再者，當病毒剛完成進入階段尚未開始復制時開展的短期感染測定表明ALKBH5缺乏并不影響病毒進入宿主細胞。野生型細胞和缺乏ALKBH5的細胞對poly（I：C）刺激作出的反應之間不存在差異。

　　在遭受病毒感染后，ALKBH5缺陷小鼠的存活率相比于它們的野生型同窩小鼠得到了改善。病毒載量在ALKBH5缺陷小鼠的幾種器官中顯著下降，而且它們的肺部具有更少的炎性細胞浸潤和減弱的病理變化。相一致的是，ALKBH5缺陷小鼠在器官和腹膜細胞中具有顯著下降的VSV復制。此外，ALKBH5缺乏還會降低體內DNA病毒HSV-1的豐度。綜上所述，ALKBH5在促進RNA病毒和DNA病毒在體外和體內復制方面起著廣泛的作用。

　　接著，這些研究人員研究了ALKBH5缺乏是否通過增強先天免疫反應來抑制病毒復制。熒光激活細胞分選儀（FACS）分析表明免疫細胞在ALKBH5缺陷小鼠體內正常發育。RNA測序（RNA-seq）顯示在遭受VSV感染的缺乏ALKBH5的巨噬細胞中，先天免疫基因的mRNA表達保持不變，甚至下降。定量PCR（qPCR）驗證還顯示當缺乏ALKBH5的巨噬細胞遭受VSV感染時，I型干擾素（IFN-I，比如IFN-β和IFN-α）、TNF-α和IL-6的mRNA水平下降了，而當這些細胞遭受其他類型的RNA病毒或DNA病毒感染時，IFN-β表達下降了。在人THP-1細胞中，敲降ALKBH5會抑制病毒誘導的IFN-I表達。ALKBH5缺乏破壞因病毒感染而引發的先天信號轉導和IRF3二聚化。相反，當遭受病毒感染時，ALKBH5過表達增加IFN-β表達。這些數據表明ALKBH5并不是通過抑制先天免疫反應來促進病毒復制。

　　再者，這些研究人員培育出ALKBH5和IFNAR1（編碼IFN-I受體）雙敲除小鼠，并且證實即便在IFN-1信號轉導不存在的情形下，ALKBH5缺乏仍然抑制病毒復制。ALKBH5缺乏也減少了干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene, ISG）和先天細胞因子表達，或者對這些基因沒有影響。在遭受RNA病毒感染后的ALKBH5缺陷小鼠的器官和腹膜細胞中檢測到較低水平的IFN-β、IFN-α、TNF-α和IL-6以及下降的先天細胞因子和ISG的mRNA表達。在遭受DNA病毒HSV-1攻擊的小鼠中，體內的ALKBH5缺乏降低了血清中的IFN-β和IFN-α產生。因此，在缺乏ALKBH5的情況下，先天免疫反應受損但不會增加，而且并不促進ALKBH5介導的病毒復制。

　　接下來，這些研究人員探究了ALKBH5在病毒-宿主相互作用中的生理意義。在病毒感染后，ALKBH5的蛋白表達和亞細胞定位沒有發生變化。但是，病毒感染降低了細胞RNA m6A去甲基化活性，而且下降的水平幾乎與ALKBH5缺乏相當。他們想知道病毒感染是否可能會損害ALKBH5的酶活性。從受到病毒感染的細胞中純化出來的ALKBH5的RNA m6A去甲基化活性下降了。再者，野生型ALKBH5而不是它的催化失活的突變體H205A的的過度表達拯救了缺乏ALKBH5的巨噬細胞中的病毒復制。因此，病毒感染會損害ALKBH5的m6A去甲基化活性。

宿主細胞破壞ALKBH5介導的RNA m6A去甲基化來抑制病毒復制。圖片來自Science, 2019, doi:10.1126/science.aax4468。

　　已知翻譯后修飾（PTM）可以調節生物過程中的酶活性，包括細胞對病毒感染的反應。比如，病毒感染可以誘導STAT1和IRF3的甲基化以增加它們的轉錄活性，從而增強先天性抗病毒免疫反應并促進清除入侵病毒。這些研究人員進行了質譜（MS）分析以確定ALKBH5的潛在PTM變化。當遭受病毒感染時，ALKBH5蛋白中的兩個殘基（R107和D109）發生去甲基化，它的另外兩個殘基（K345和R349）發生甲基化。他們分別用氨基酸殘基Q取代質譜分析中確定出的發生甲基化的R（R107Q），用A取代K（K345A），用A取代D（D109A），從而構建出ALKBH5突變體。當這些突變體在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中過表達時，僅R107Q突變體不能移除RNA m6A修飾，類似于催化失活的H205A突變體。這些結果表明R107去甲基化可能會損害ALKBH5的m6A去甲基化活性。他們隨后使用無細胞生化系統來比較重組野生型ALKBH5、R107Q突變體和作為對照的H205A突變體的m6A去甲基活性，結果發現H205A突變體和R107Q突變體表現出受損的m6A去甲基活性。因此，為了應對病毒感染，宿主細胞會積極地誘導ALKBH5蛋白上的R107去甲基化以損害它的酶活性，從而導致受到病毒感染的細胞中的RNA m6A去甲基化活性減弱，這樣就可抑制病毒復制。

　　為了確定ALKBH5的關鍵下游靶標，這些研究人員對RNA-seq數據進行了KEGG途徑富集分析，結果發現在缺乏ALKBH5的巨噬細胞遭受病毒感染時，代謝途徑受到的影響最大。RNA-seq數據揭示出在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中，很多代謝相關基因發生顯著變化。再者，代謝組學分析表明ALKBH5缺乏導致體內代謝產物譜受到擾動。

　　接著，這些研究人員證實在遭受病毒感染后，9個主要的代謝相關基因在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中顯著下調或上調。在這些基因中，基因OGDH（編碼α-酮戊二酸脫氫酶）是最顯著下調的基因。ALKBH5缺乏或病毒抑制都可顯著下調OGDH表達。在不同類型的RNA病毒或DNA病毒感染后，OGDH表達也受到下調，但是對TLR配體刺激作出的反應中，仍然保持不變。再者，人們之前已報道，在遭受人類大流行性病毒感染后，OGDH表達受到抑制。對這9個代謝相關基因進行功能性篩選表明OGDH敲降最為強有力地抑制病毒復制，并且伴隨著下降的IFN-β表達和對ALKBH5缺乏的表型模擬。除了Scgb1a1敲降抑制病毒復制的效力不如OGDH敲降之外，敲降其他的代謝基因不會產生這樣的抑制效果。其他未參與三羧酸循環（TCA cycle）的候選基因并沒有與這種過程中的OGDH發生交叉調節。此外，在人THP-1細胞中，OGDH敲降降低病毒復制和IFN-I表達。因此，抑制代謝酶OGDH表達是宿主細胞中抑制病毒機制的一個通用機制。

　　OGDH是三羧酸循環中的第一限速酶。在此之前還沒有關于OGDH在病毒感染中起作用的報道。利用兩種OGDH抑制劑---琥珀酰磷酸酯（SP）和CPI-613---對野生型巨噬細胞進行藥物處理，可以劑量依賴性地抑制病毒復制。OGDH過表達拯救了缺乏ALKBH5的巨噬細胞中的病毒復制。然而，ALKBH5在OGDH受到沉默的細胞中的過表達無法挽救病毒復制。因此，ALKBH5在代謝上通過上調OGDH來促進病毒復制。

　　靶向代謝組學分析表明OGDH沉默改變了受到病毒感染的巨噬細胞中的幾種重要的代謝中間產物的水平。水平下降的代謝中間產物之一是已知可以促進病毒復制的天冬氨酸，這與之前報道的OGDH沉默會耗盡天冬氨酸相一致。衣康酸（itaconate）是病毒感染后OGDH受到沉默的巨噬細胞中最顯著下調的代謝中間產物之一。衣康酸由作為TCA循環的中間產物之一的順-烏頭酸（cis-aconitate）轉化而來，它在OGDH受到沉默的巨噬細胞中的水平也下降了。作為脂多糖處理的巨噬細胞中的最豐富的代謝產物，衣康酸通過調節線粒體呼吸作用和代謝重塑或者通過KEAP1烷基化激活Nrf2而發揮著抗炎作用。然而，衣康酸在調節病毒復制中的作用仍然未知。利用細胞滲透性的衣康酸衍生物衣康酸二甲酯（dimethyl itaconate, DMI）處理缺乏ALKBH5的巨噬細胞可以劑量依賴性地拯救病毒復制。另一種細胞滲透性的衣康酸衍生物衣康酸4-辛基酯（4-octyl itaconate）強效地拯救了病毒復制。衣康酸4-辛基酯也在OGDH受到沉默的巨噬細胞中拯救了病毒復制，并以劑量依賴性的方式促進病毒復制。

　　ALKBH5-OGDH-衣康酸（ALKBH5-OGDH-Itaconate）軸在體內的作用是什么？在遭受病毒攻擊的小鼠中，體內的ALKBH5缺乏下調OGDH表達和衣康酸產生。值得注意的是，給缺乏ALKBH5的小鼠提供衣康酸足以拯救病毒載量和病毒復制，同時不會影響OGDH在體內的mRNA轉錄和蛋白表達。有趣的是，增加的血清干擾素（IFN）水平可在給予衣康酸的小鼠體內觀察到。這些結果證實ALKBH5-OGDH-衣康酸途徑以一種不依賴于IFN的方式促進病毒復制。

　　由ALKBH5缺乏引發的m6A RNA甲基化增加是否直接導致OGDH的下調表達？這些研究人員通過m6A-seq測序對野生型巨噬細胞和缺乏ALKBH5的巨噬細胞進行全轉錄組范圍的m6A甲基化分析，分析結果展示出具有典型m6A峰分布特征的共有m6A基序。在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中，VSV RNA上的m6A信號沒有上調，這就排除了ALKBH5通過靶向病毒RNA的m6A修飾來促進病毒復制。已有人報道了METTL3缺失可降低IFN-β mRNA上的m6A水平，從而增加它在包皮纖維原細胞中的表達。然而，他們的m6A-seq數據表明m6A信號在野生型巨噬細胞和缺乏ALKBH5的巨噬細胞之間無顯著差異，這進一步證實ALKBH5以一種不依賴于IFN的方式促進病毒復制。

　　m6A-seq數據表明OGDH mRNA上存在高度富集和特異性的m6A峰，這些m6A峰在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中顯著升高。m6A-RIP和qPCR的聯合使用證實OGDH mRNA發生m6A修飾，而且當ALKBH5缺乏時或者在病毒感染期間，OGDH mRNA上的m6A水平會進一步升高。野生型ALKBH5而不是H205A或R107Q突變體的過表達拯救了缺乏ALKBH5的巨噬細胞中的OGDH表達。因病毒感染而受到損害的ALKBH5的去甲基化活性導致OGDH表達下調和m6A去甲基化底物。

　　這些研究人員隨后利用iCLIP-seq技術繪制了ALKBH5的靶轉錄本和結合位點，并證實ALKBH5直接靶向巨噬細胞中的OGDH轉錄本。通過聯合使用ALKBH5-iCLIP-seq和m6A-seq數據，他們鑒定出OGDH mRNA上的重疊峰，并且發現ALKBH5與OGDH mRNA之間的結合在病毒感染時下降了。其他的RNA，比如在代謝上參與病毒復制的GOT2基因的mRNA轉錄本，都是ALKBH5的靶標和m6A去甲基化底物。因此，通過OGDH RNA和其他轉錄本的去甲基化，ALKBH5介導的代謝重編程在調節病毒復制中起著重要作用。

　　在此之前，人們已發現m6A RNA修飾通過調節mRNA的剪接、穩定性和翻譯而能夠調節基因表達。在這項新的研究中，他們的m6A-seq數據表明野生型巨噬細胞和缺乏ALKBH5的巨噬細胞中的替代性剪接模式并不存在任何顯著的不同。RNA衰減測定表明OGDH mRNA在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中顯著下降。m6A RNA修飾可以促進mRNA降解，并且可被一系列讀取蛋白加以特異性識別，其中YTHDF2是負責m6A修飾的mRNA衰減的主要m6A讀取蛋白。在缺乏ALKBH5的巨噬細胞中，沉默YTHDF2可延遲OGDH mRNA降解和拯救病毒復制。總之，ALKBH5直接擦除OGDH mRNA上的m6A RNA甲基化來延遲它通過YTHDF2介導的衰減，這使得OGDH蛋白表達增加，從而在代謝上促進病毒復制。

　　終上所述，在這項新的研究中，這些研究人員闡明了宿主細胞通過削弱ALKBH5的去甲基化活性積極地對病毒感染作出反應，這會導致增加的OGDH mRNA衰減和下降的OGDH蛋白表達，從而對細胞代謝狀態進行重編程而使得宿主對病毒感染產生不依賴于IFN-I的抵抗力。下降的OGDH表達限制了三羧酸循環并減少病毒復制所需的衣康酸的產生，因而限制了宿主細胞中的病毒感染。他們認為m6A RNA修飾和代謝重編程之間通過ALKBH5-OGDH-衣康酸途徑進行的交談對細胞通過與先天反應無關的代謝重編程抵御入侵的病原體提供了機制上的新見解。鑒定宿主-病毒相互作用中的細胞代謝物有助于更好地理解病毒感染過程，并有助于確定潛在靶標以便進行干預。這項新的研究表明OGDH和衣康酸以一種不依賴于先天免疫反應的方式促進病毒復制，并提出通過靶向OGDH-衣康酸代謝反應來控制病毒感染性疾病。