李勁松，于翔最新文章：CRISPR技術構建基因功能分析方法

　　來自中科院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組和中國科學院神經科學研究所于翔研究組合作發表了最新成果：利用CRISPR/Cas9技術和細胞譜系示蹤技術對小鼠兩細胞胚胎中的單個卵裂球進行了基因敲除，一步法獲得了Tet3基因敲除的健康嵌合小鼠，并對Tet3基因敲除后大腦皮層和海馬神經元的突觸傳遞進行了探究。該方法是一種快速地分析致死基因在各個組織器官中功能的新方法。

　　這一研究成果公布在Cell Research雜志上，文章的通訊作者是李勁松研究員和于翔研究員，第一作者是汪凌波博士和李敏寅博士。

　　DNA雙加氧酶Tet3是Tet蛋白家族的一個重要成員，之前的研究發現， Tet3全身性敲除小鼠有部分可以發育到出生，但是出生后24小時內死亡。因此，若想研究Tet3在成年小鼠中的功能，需要借助Cre/loxP系統在不同的組織中進行特異性的敲除。這就帶來一系列的問題：待研究的組織是否有特異性的Cre小鼠資源；若想在不同組織中研究基因的功能，則需要不同的Cre小鼠；條件性敲除小鼠交配周期長。

　　在此基礎上，研究人員提出了一種基于嵌合體的快速分析致死基因潛在功能的方法。

　　首先，他們在mT/mG小鼠胚胎的一細胞時期（受精卵時期）注射了Cas9 mRNA，而后在兩細胞時期，隨機地在兩細胞的其中一個卵裂球注射Cre mRNA和Tet3 sgRNAs。將這些注射過的胚胎移植到假孕小鼠體內，就可以獲得Tet3敲除的嵌合鼠，這些嵌合鼠可以正常成活，并且在各個組織器官中都有紅色/綠色兩種細胞存在，其中紅色細胞是野生型，綠色細胞是Tet3敲除的。為簡化基因型鑒定同時為保證敲除的成功率，研究人員進一步將多個sgNRAs（3-4個）注射到單個卵裂球中，這種策略得到的小鼠很容易通過PCR條帶鑒定出是否有大片段敲除，同時可以把一整個外顯子刪除掉保證了敲除的成功率。他們對這些嵌合體小鼠的大腦進行分析，發現Tet3敲除并不影響大腦皮層主要細胞類型的發育和分化。

　　之后研究人員進一步通過對鄰近的野生型和Tet3敲除細胞進行成對電生理記錄，發現Tet3敲除之后，小鼠大腦皮層和海馬錐體神經元的興奮性與抑制性突觸傳遞均發生了顯著性的改變，表現為興奮性突觸傳遞的上調和抑制性突觸傳遞的下調。研究結果提示Tet3在大腦不同腦區神經環路的發育中起到了重要的作用。

　　這種技術方法的優越性主要在于：對于致死基因，可以一步法獲得嵌合小鼠，用于探究該基因在不同組織器官中的作用；在同一個個體內，野生型細胞是基因敲除型細胞的嚴格對照；基因敲除型細胞可以零星地散布在各個組織中，有助于研究基因的自主性和非自主性功能。