1.概述
1.1.相對響應因子(Relative response factor，RRF)的概念
RRF一般應用于原料藥或者藥物制劑色譜分析方法中，對有關物質(如雜質或者降解雜質)的精確定量或者活性藥物原料(API)的純度檢查。用于校正不同化合物在不同的分析方法中檢測器信號響應的差異，一般為各種雜質對于API的相對信號響應，各國藥典(包括USP，EP，BP等)對其表述大同小異，可簡單描述為：單位質量(質量濃度)的雜質與API的檢測信號響應之比(RFimp/RFapi)。
1.2.影響RRF的因素
影響RRF的因素有很多，其中包括化合物本身的性質也包括分析方法條件的設置，以配置PDA檢測器的HPLC分析方法為例，將RRF影響因素列于下表1中(不限于)。
HPLC以及GC是制藥行業應用最多的分析儀器，其配置的各種檢測器包括通用型檢測器以及一些化合物特異性檢測器，如GC通用型FID檢測器對幾乎所有有機化合物均有較好的響應，ECD，FPD檢測器則是檢測譜相對比較窄的化合物特異檢測器；HPLC通常配置的PDA，ELSD，CAD，MSD檢測器均為通用型檢測器，CLND作為一款化合物特異性檢測器則不常用。不同的化合物在不同的檢測器下往往具有不同的響應因子(RF，如PDA檢測器的不同檢測波長下RRF有可能差異很大)，在使用色譜積分面積百分比考察樣品純度時，就需要以API的RF為基準對相關雜質的RFs做校正，保證樣品純度測試結果的準確可信。
除上述所列的分析條件的改變會影響RRF之外，其他任何常見的方法的改變亦會影響RRF。在使用PDA作為檢測器，其他分析條件既定的情況下，波長的選擇對于RRF的影響是絕對影響因素，不同的化合物具有不同的紫外吸收光譜(無共軛作用化合物一般無紫外吸收)，因此在不同的檢測波長下，RRF測定值有所區別(以下RRF均以PDA作為HPLC檢測器)。
1.3.RRF的應用范圍
RRF在不同目的的分析方法中均有廣泛的應用，如In-Process-Control，純度檢測，Mass balance調查，雜質限度測試與制定以及Stability/Impurity indicating(按照ICH Q3B R2要求，RRF在0.8-1.2)等。
在API工藝研發過程中，In-Process-Control分析方法(HPLC)需要對反應過程進行監測與控制并以原料的轉化率或剩余量設定合適的反應終點，在對色譜圖處理時一般采取面積歸化法判斷反應是否到達終點。如果原料與產物之間RRF超出范圍(0.8-1.2，就需要對其進行RF校正之后再以面積歸一化法，報告檢測結果。
在純度以及Stability/Impurity indicating測試時，更應該對相關雜質或相關降解雜質的RRF進行測試。尤其是在Stability/Impurity indicating測試時，各種降解條件（參照ICH Q series）產生的相關降解雜質UV譜有可能保持相對一致（分子母核保持不變，活性基團降解，交換等），也有可能差異較大或者吸收很弱甚至在該檢測波長下無明顯的紫外吸收（如含氮、硫雜環開環等）；此時，若不對RF進行校正，則極易引入Mass balance問題。在對RF不一致導致的Mass balance問題進行調查時，與UV聯用ELSD或者CAD檢測器一般會有助于發現該問題（下圖1A以及1B）。
此外，雜質限度測試與制定亦需要對其RRF進行測試，以此對其絕對含量進行校正。
2.RRF測定方法
RRF的測定方法有很多，包括以PDA作為檢測器直接測定，也有間接測定方法，實際測定時需要根據具體條件以及資源可利用情況，靈活做出選擇。
2.1RRF直接測定法
PDA檢測器作為一款濃度型通用型檢測器，具有最寬泛的應用范圍。其信號響應與化合物的濃度呈直接線性相關，其基本構造如下圖2所示。
依據RRF被廣泛接受的定義，利用RRF=(Response Areaimp/Concentrationimp)/(Response Areaapi/Concentrationapi)可對其以PDA作為檢測器進行直接測定。直接測定需要得到對照品級別的相關物質或雜質以及API，具體有以下幾種方法：
（1）單濃度點法，準備已知濃度的特定物質/雜質對照品和API溶液，可分別進樣也可作為混合溶液HPLC進樣，按照上式計算RRF。
（2）多濃度點法，準備高、中、低濃度的特定物質/雜質對照品和API對照品溶液（注意樣品濃度不能超載），HPLC進樣并計算RRF，以平均值作為最終RRF。
（3）標準曲線法，分別制備0.1%-1.0%的系列濃度溶液（涵蓋定量限），得到相應的標準曲線，曲線斜率之比即為RRF。
（4）吸收系數法：PDA作為檢測器時，RRF為相關物質于檢測波長處的紫外吸收系數之比，可按照A=lg(1/T)=Kbc分別計算K，摩爾吸光系數，之后以各自相對分子質量校正之后相比得到RRF。
從上述表述中亦可以看出直接法測定相關物質/雜質的RRF，均需要得到對照品級別或者已知重量含量的相關物質/雜質，很多時候并不能到達該要求。如Stability/Impurity indicating測試時，不可能事先準備相關降解雜質，盡管在雜質之后得到這些降解雜質的Impurity profile并利用Q-TOF得到相關雜質的精確分子量或者花費大量資源明確其結構，進而對其進行合成亦需要自此花費大量的人力以及物力（不具備制備需要的量）。而有時，縱然花費了大量的人力、物力，短時間內也不一定能夠對其進行合成以及純化。
2.2 RRF間接測定法
間接測定法主要是指將UV-PDA檢測器與其他濃度相關型檢測器如CAD，ELSD，CLND，MSD等進行串聯（串聯方式如下圖3所示），進而對RRF進行測定。
CAD（charged aerosol detector，電噴霧檢測器）作為另外一款通用型HPLC檢測器具有靈敏度高，不同化合物的響應一致（表2），重現性好，檢測范圍較寬且信號響應不依賴與化合物本身的共軛性質等特點，但受流動相的組成變化影響較大，其簡單工作原理如下圖4所示。
在較寬濃度范圍內，CAD檢測器的信號響應與樣品濃度并不呈直接線性相關，而具有Y=aXb的關系（Y，色譜積分面積；X，樣品濃度），但在較窄的濃度范圍內（0.1%-1.0%）則呈現較好的直接線性相關。此外，CAD對于結構相關化合物表現出信號響應的高度一致性，特別適合于Stability/Impurity indicating樣品進行分析。
在以UV-CAD串聯的方式對RRF進行測定時，可按照下式進行計算
在以Gradient方式對樣品進行分析時，為消除梯度變化對于RRF的影響，可在樣品中添加已知濃度的已知雜質作為內標對計算方式進行校正，或者使用雙梯度（圖5A與5B）對RRF進行校正。
下圖6為典型Stability/Impurity indicating樣品利用UV-CAD對相關降解雜質進行分析并測定RRF的色譜圖，其中圖6A為已知結構以及濃度的9個相關物質（內標）的UV-CAD圖譜，圖6B為降解樣品UV-CAD圖譜。
其中Photodegradant雜質為光降解雜質，為加入的內標之一，以直接測定法得到的RRF與UV-CAD法測得的RRF進行比較，表3，可以看出兩種測定方式保持了高度一致性。
ELSD（charged aerosol detector，電噴霧檢測器）作為與CAD類似的檢測器，同樣可以UV-ELSD的方式對相關物質/雜質的RRF進行測試。與CAD類似，信號響應與樣品濃度并不呈直接線性相關，而具有Y=aXb的關系，但在較窄的濃度范圍內（0.1%-1.0%）則呈現較好的直接線性相關，RRF計算方式可參照CAD檢測器。
其檢測性能上要稍遜與CAD檢測器，具有與CAD檢測器一樣的缺點，即RF對流動相的組成變化比較敏感，但可以以同樣的方式克服，其基本檢測原理如下圖7所示。
與CAD檢測器類似地，樣品從色譜柱流出之后經過霧化，蒸發，檢測三步。下圖8為將HPLC-UV-ELSD應用于某一API在酸性環境下降解樣品的分析以及相關雜質RRF的測定。
該實例分別測試了50 ug/mL以及125 ug/mL濃度的API中的相關降解雜質的RRF，如下表4所示。
上述數據說明UV-ELSD的方式可以對相關雜質的RRF進行簡單測定，且在228 nm的檢測波長下，降解雜質B的RRF超過0.8-1.2的范圍，需要對分析方法的檢測波長進一步優化選擇。
一般地，MSD檢測器不能以與UV-PDA檢測器聯用的方式測定相關物質/雜質的RRF，這是因為不同的化合物其離子化能力不一樣，導致信號響應與化合物的濃度之間很難建立起一定的數學模型。但其可以結合CLND檢測器(Chemiluminescent Nitrogen-specific Detector，氮化學發光檢測器)一起與UV-PDA聯用對RRF進行測定(CLND工作原理簡圖如圖9A，氮化學發光原理如圖9B)。
該檢測器的信號響應與樣品分子的氮含量呈線性關系，檢測限度可達ng氮級別(如圖10)，但改檢測器只對含氮化合物具有響應(但不能含有N=N以及N-N結構)，流動相不能使用乙腈以及含氮添加劑。
以CLND檢測器串聯UV-PDA檢測器測定相關物質/雜質的RRF，往往需要知道該物質/雜質的精確分子量進而計算其分子式，確定其含有幾個氮原子。RRF的計算可按照下式進行。
其典型應用圖譜如下圖11所示，測定結果見下表5。
3. 結論
RRF作為重要的色譜方法學參數，其值取決于化合物本身的紫外吸收光譜性質以及所用PDA檢測器的波長，測定準確的RRF值對于相關物質/雜質研究非常重要。直接法測定簡單，易于操作，但往往需要得到已知重量含量的較純樣品，因此尋找其他可替代間接方法對RRF進行測定具有比較現實的意義。以HPLC-UV串聯CAD，ELSD或者CLND檢測器的方式對RRF進行測定，可不用獲得較純樣品，實現在線測定。在實際應用中，可根據需要以及資源可支配情況，進行靈活選擇。