植物組織培養再生的步驟

一、接種

組織培養的接種是指將滅過菌的材料，在無菌的情況下，切成小塊，放入培養基的過程。科研、生產部門的接種工作，多在無菌室或超凈工作臺上進行，中學可制作接種箱，在箱內進行接種。接種的方法步驟如下：

1、在無菌室或接種箱中放好接種時所需要的酒精燈、貯存70%酒精和棉球的廣口瓶、各種鑷子、接種針、解剖刀、手術剪、火柴、培養基等。

2、在無菌室或接種箱內用紫外燈滅菌(無菌室照射20～50分鐘，接種箱照射15分鐘)。

3、放入已滅菌的接種材料(用培養皿盛取)。同時，操作人員用酒精棉球擦手，并對接種工具用酒精燈火焰燒灼。

4、用手術刀片將材料切割成若干片段，并迅速接種入培養基中。接種時，錐形瓶(或試管)應斜向火焰，在酒精燈火焰附近操作。

5、材料接種好后，將錐形瓶瓶口在酒精燈火焰上轉動燒一遍，蓋好瓶蓋，注明材料名稱及接種日期。

材料接種后，應置于26～28℃的培養室中進行培養。

二、植株誘導

本階段是組織培養中最重要的一環。在培養基中植物  激素的作用下，外植體通過三條途徑迅速增殖，這就是側芽增殖、誘導不定芽的形成和誘導胚狀體的形成。

1、側芽增殖

種子植物  的每個葉腋中通常都存在著腋芽，在一定條件下可以使它生長。現在知道頂端優勢抑制側芽生長，可被外源的細胞分裂素打破，所以在利用側芽增殖這條途徑時，培養基中幾乎都要加入細胞分裂素(有時也加入少量生長素)。由于細胞分裂素的持續作用，側芽不斷分化和生長，逐漸形成芽叢。如果反復切割和轉移到新的培養基上繼代培養，就可在短期內得到大量的芽。 側芽增殖的主要優點是能保持遺傳的穩定性，因為莖尖的細胞常是均一的二倍體細胞，它不易受培養條件的影響而發生變異，也易于保持嵌合體的性狀。目前已有近百種植物可以用這種方法進行繁殖，如草毒(Fragaria ananassa Duch.)、蘋果、葡萄(Vitis vinifera L.)、唐菖蒲(Gladiolus gandavensis Houtt.)、非洲菊、月季(Rosa chinensis Jacq.)、甜菜(Beta vulgaris L.)和鳳梨(Ananas comosus(L.) Merr.)等。 關于培養基中加入細胞分裂素的濃度，是0.1～10.0毫克/升，一般為1.0～2.0毫克/升。在幾種細胞分裂素中用的最多的是6-芐基嘌呤，其次是激動素和異戎基腺苷，玉米素用的很少。 除了細胞分裂素之外，在培養基中還經常加入低濃度的生長素以促進腋芽的生長。常用的生長素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸(濃度為0.1～1.0毫克/升)。

2、不定芽的誘導形成

在自然條件下，很多種植物  的器官可以產生不定芽。在培養條件下，由于所需要的外植體很小又加上激素的作用，可以使這種產生不定芽的能力得到極好的發揮，如秋海棠或非洲紫羅蘭(Saintpaulia ionantha Wendl.)用常規的葉插法繁殖時，每片葉只能產生幾個到十幾個芽，但用葉切段在培養基中可產生成千上萬個芽。在培養條件下，還能使自然條件下不產生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜(Brassica oleracea L.var.capi-tata L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的葉、菊花[Dendranthema morifolium(Ram.) Tzvel.]的花和葉片、百合(Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker)和水仙的鱗片以及萱草(Hemerocallis fulva L.)的花莖等。 在誘導外植體形成不定芽時，一般使用細胞分裂素高于生長素比值的激素配比，少數情況下也采用二者比值接近1的配比。常用的細胞分裂素是6-芐基嘌呤，激動素和玉米素，濃度范圍一般在0.1～10.0毫克/升。生長素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其濃度范圍與細胞分裂素相同。為了使外植體形成不定芽，外源激素的供應只是一個方面，器官分化的性質還要決定于內源激素的狀況。因此，對于不同的植物，使用的激素種類和濃度常有較大的變化。在具體操作時，應參考已有資料或相近種類的已有結果，以確定適當的濃度和配比。

3、胚狀體的誘導形成

在自然界只有少數植物  可以由珠心產生胚狀體。在培養條件下，現在已有30多個科的150多種植物可以產生胚狀體。在誘導胚狀體的形成時，其外植體一般取自胚、分生組織或生殖器官。為了獲得胚狀體，在培養過程中，培養基中應含有豐富的還原氮，并加入生長素(主要是2，4-D)誘導胚狀體的發生。待胚狀體發生后，要轉移到降低濃度或沒有生長素的培養基上進行培養，使胚狀體成熟和生長。

胚狀體途徑的優點是增殖率高，而且胚狀體既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根這一步驟。但目前很多重要作物還不能形成胚狀體，或產生的胚狀體難以形成植株，另外胚狀體遺傳性也容易發生變異，所以目前除柑桔(Citrus)、油棕(Elaeis guine-ensis Jacq.)和咖啡(Coffea)等少數作物外，都不采用這一途徑。

三、生根

生根是獲得完整植株的一個關鍵。通過側芽和不定芽途徑產生的芽長成嫩枝后(此時的嫩枝叫試管苗)，必須誘導生根才能移植。促使試管苗生根的方法通常有兩種。一種是在固體培養基上誘導生根。當試管苗長到2～3厘米高時，將它從基部切下，轉移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固體培養基上生根。另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時間從幾小時到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養基上，十天左右即可生根。

以上兩種方法，在更換培養基后，經過幾天，都要將試管苗的瓶口打開，上蓋1～2層紗布，以便于通氣。并要適當加強光照，以增加試管苗的自養能力。

四、移栽

當試管苗的根原基突起或形成幾毫米長的短根時，將其取出，洗去瓊脂  ，載入有少量營養的人工基質中。移栽后，保持高濕度，避免陽光直射和過大的溫度波動，經過一段逐步鍛煉的過程，再定植到土壤中。

在移栽過程中，試管苗的環境條件發生了劇烈的變化，其本身又從異養變到自養，葉的光合作用和根的吸收作用需要逐漸發展。因此移栽時要小心控制，使試管苗逐步鍛煉，最終能在土壤中生活。