植物細胞骨架的顯示及光鏡觀察

實驗概要

植物細胞骨架的顯示及光鏡觀察

實驗原理

 細胞內由微絲、微管、中間纖維等交織形成一個十分復雜的立體網絡結構。它們對于細胞形狀的保持、細胞內物質運輸、細胞運動、細胞內各結構相對位置的固定都有重要作用，故而稱為細胞骨架。
 

     
細胞骨架在通常固定條件下不穩定，如低溫、高壓、酸處理等。當采用適當的手段，如M-緩沖液洗滌細胞，可以提高細胞骨架的穩定性，戊二醛在室溫下固定能較好的保存細胞骨架的成分，另外，Triton X-100處理能抽取掉一部分 雜蛋白，可使骨架成分顯現的更加清晰。
 

     
微絲、微管、中間纖維等都是直徑很小的結構。最大的單根微管才25nm左右，只能在電鏡下才能看見，目前研究細胞骨架的主要方法是應用高壓電鏡或免疫熒光顯微技術，本實驗用普通光鏡觀察到細胞骨架，是因為骨架纖維成束分布，結構經染色以后，有夸大作用。由于細胞經Triton X-100提取剩下的主要成分是細胞骨架成分，使得顯現等價清晰。

主要試劑

M-緩沖液（配制方法如下）：

        咪唑              2.90g

        KCl               3.70g              MgCl2            0.012g

        EGTA             0.38g               EDTA            0.042g

      巰基乙醇     0.086ml        加水到          1000 ml                  

6mM磷酸緩沖液

        KH2PO4                         0.74g 

        Na2HPO4?12H2O            2.4g

        加水到                   1000 ml

　　　　    
１％Triton X-100：以M-緩沖液配制

　　　    
３％戊二醛： 25％戊二醛  12 ml   6nm磷酸緩沖液   88 ml  
               
染料： 考馬斯亮藍 R-250     0.2g     冰醋酸        7 ml                                                
甲醇                              46.5 ml     蒸餾水             46.5 ml

主要設備

   器材：顯微鏡、燒杯、吸管、鑷子、載片、蓋片

實驗材料

   材料：洋蔥鱗莖

實驗步驟

１.撕取洋蔥鱗莖內表皮表皮細胞（約1cm2）若干片置于盛有6mH  pH6.8磷酸緩沖液中，使其下沉。
 

２.吸去磷酸緩沖液，加入１％Triton X-100處理２０－３０分鐘
。

３.吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗三次，每次三分鐘。
 

４.３％戊二醛固定３０－６０分鐘。
 

５.pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次十分鐘。
 

６.0.2%考馬斯亮藍 R-250染色20-30分鐘。
 

７.用蒸餾水洗1-2次，細胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學顯微鏡下觀察，就可以看到由微絲、微管組成的網絡。