植物蛋白質組學和糖基化實驗（一）

實驗材料 鏈霉親和素-過氧化物酶牛胰核糖核酸酶 B甲基比喃甘露糖苷卵清白蛋白

試劑、試劑盒 DIG 糖鏈檢測試劑TTBS 緩沖液Lectin- biotinTBS 緩沖液

實驗步驟

3.1 這個蛋白質是糖蛋白嗎

只有一種方法能全面的回答“這個蛋白質是糖蛋白嗎?”這個問題。這需要使用能檢測并定量印記上糖蛋白的總糖檢測試劑盒。Roche  Applied  Science 公司商業出品----DIG 聚糖檢測試劑盒（產品包含使用說明）提供了這些測定所需的試劑。需要指出的是，在使用這個試劑盒時，蛋白質至少結合有一個糖苷部分才能獲得實驗結果，這些檢測無法提供參與糖基化的寡聚糖分子的類型和其與蛋白骨架連接的相關信息。

3.2 蛋白質是怎樣被糖基化的

有幾種方法可以用來進行糖蛋白上糖苷特性的鑒定，一種方法包括應用糖蛋白寡糖部分的特異性探針的 Western印跡實驗，這種探針有凝集素型和抗體型兩種類型。這個方法既不需要進行糖蛋白樣品的純化，也不需要糖苷的解離或分離（見 25. 3. 2 節 1.1)。另一種方法是分離糖蛋白，直接分析與糖蛋白連接的糖苷的單糖組成（見 25.  3.2 節 2.1)。還有一種方法是經化學或酶學處理，將純化獲得的糖蛋白上的糖苷選 擇性解離下來。接著通過電泳或質譜對去糖基化之前或之后的糖蛋白進行分析（見 25. 3. 2 節 2.1)。選擇性裂解會為我們帶來與糖蛋白連接的糖苷的特性。與此同時，通過質譜鑒定到的蛋白分子質量的差異將為我們提供與糖蛋白連接的糖苷的結構信息。

1. Western 印跡檢測糖苷的方法

一維或二維電泳膠的 Western 印跡可用來檢測糖蛋白上糖苷。用于這種檢測的探針大多具有 N- 連糖苷特異性。

1 ) 凝集素親和檢測

凝集素是一類可與寡聚糖部分特異結合的植物蛋白質，它們已被鑒定出具有對哺乳動物糖蛋白的親和性，這些凝集素列于表25-1 中，其中只有一少部分可用于植物糖蛋白的檢測（見注釋 2) 。

這類凝集素商品是凝集素-生物素化形式。通過鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標識物，辨別凝集素和寡糖。但是，唯有刀豆球蛋白 A 例外，因為它可直接結合到過氧化物酶上。下面是這兩種方案的具體內容：

凝集素- 生物素/鏈霉親和素-過氧化物酶方法：

( 1 ) 通過 1D 或 2D 電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。

( 2 ) 用 TTBS 緩沖液浸泡印跡膜 1 h ( 見注釋 3) 。

( 3 ) 將印跡膜在含有凝集素-生物素復合物（0.1 mg/20 ml) 的 TTBS 緩沖液中，室溫下浸泡 2 h。

( 4 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 將印跡膜在以 1：1000 稀釋在 TTBS 緩沖液中的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標物中，室溫下溫育 1 h。

( 6 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗印跡膜 4 次（每次 15 min) ，顯影前在 TBS 溶液中漂洗一次。

( 7 ) 在一個燒杯中將 30 mg 4-氯-1- 萘酚溶解在 10 ml 冷甲醇中（一20℃），在另一個燒杯中的 50 ml TBS 緩沖液中加入 30 μl H2O2。在要顯影印跡膜時，合并上面這兩個燒杯中的溶液，配制成過氧化物酶顯影混合液（要現用現配），輕輕搖動來優化顯影反應。

( 8 ) 倒掉顯影混合液，并用蒸餾水漂洗印跡膜數遍，終止顯影反應。晾干印跡膜，夾在兩層濾紙之間保存。

( 9 ) 實驗對照，請見注釋 4 。