概述熒光定量PCR技術的原理

又稱實時PCR技術。該技術在常規PCR基礎上，添加了一條標有兩個熒光基團的熒光雙標記探針，一個標記在探針的5′端稱為報告基團(Reporter，R)；另一個標記在探針的3′端稱為熒光抑制基團或稱淬滅基團(Quencher，Q)。兩者可構成能量傳遞結構，即5′端R發出的熒光信號可被3′端R基團抑制。3′端的-OH已被封閉，不具有延伸的能力。探針引物在無特異性PCR擴增時，熒光信號不改變。在PCR反應開始后，隨著鏈的延長，熒光定量PCR的Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標記探針的結合部位，發揮它的5′-3′外切酶活性，將熒光探針切斷。一但切斷，Q基團的抑制作用消失，從而引起R基團的熒光信號增長，被釋放的游離R基團的數目和PCR產物的數量是一對一的關系，因此R基團的熒光信號的強弱就與PCR產物的數量成正比關系。測定出前者就可以推算出后者。這就是熒光定量PCR的原理。在PCR的過程中，連續不斷地檢測反應體系中的熒光信號的變化，當信號增強到某一閾值時(根據熒光信號基線的平均值和標準差，計算出99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即閾值)，此時循環次數(ct)就被記錄下來，該循環參數和PCR體系中起始DNA量的對數值之間有嚴格的線性關系，利用陽性梯度標準品的ct值，制成標準曲線，再根據樣品的ct值就可以準確定出起始DNA的拷貝數。