武漢病毒所Nature發文：揭示肺炎疫情很可能由蝙蝠導致

　　在過去的二十年中，冠狀病毒已引起兩次大規模疫情：嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和中東呼吸綜合征（MERS）。一般認為，主要在蝙蝠中發現的SARS 相關冠狀病毒（SARSr-CoV）可能會導致未來疫情暴發。

　　在一項新的研究中，中國科學院武漢病毒研究所、武漢金銀潭醫院和湖北省疾病預防控制中心的研究人員報道了位于中國中部的湖北省武漢市發生了一系列病因不明的肺炎疫情。從當地的一家海鮮市場開始，到2020年1月26日為止，疫情已蔓延至中國有2050人感染，其中56人死亡，其他11個國家有35人感染。相關研究結果于2020年2月3日在線發表在Nature期刊上，論文標題為“A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin”。重要的是，Nature期刊在2020年1月20年收到這篇論文的手稿，1月29日就接受了這篇論文，并以“加快評審文章（Accelerated Article Preview）”的形式了在線發表了這篇論文。論文通訊作者為中國科學院武漢病毒研究所石正麗（Zheng-Li Shi）研究員。

　　這些患者的典型臨床癥狀是發燒、干咳、呼吸困難、頭痛和肺炎。疾病發作后可因肺泡損傷導致進行性呼吸衰竭（如橫向胸部CT圖像所觀察到的那樣），甚至死亡。根據臨床癥狀和其他標準，包括臨床體溫升高，淋巴細胞和白細胞減少（有時白細胞正常），胸部X光片上出現新的肺部浸潤，三天抗生素治療無明顯好轉，臨床醫師將這種疾病確定為病毒性肺炎。大多數早期病例似乎都與最初的那家海鮮市場有接觸史，但是如今這種疾病已發展為人與人之間的傳播。

　　在疫情開始時就進入了重癥監護病房（ICU）的7名重癥肺炎患者（其中有6名是海鮮市場銷售者或送貨者）的樣本被送至中國科學院武漢病毒研究所（WIV）實驗室進行病原體診斷。考慮這次疫情發生的環境與SARS相同，即在冬季和在一家海鮮市場里，石正麗及其課題組在冠狀病毒（CoV）實驗室中首先使用泛冠狀病毒PCR引物來測試這些樣本。他們發現了5個PCR陽性樣本。通過使用下一代測序（NGS）對從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中收集的樣本（WIV04）進行宏基因組分析以鑒定潛在的病原體。

　　在總共10038758個讀取片段（read），或者說人類基因組過濾后的總共1582個讀取片段中，有1378個讀取片段與SARSr-CoV序列相匹配（圖1a）。通過從頭組裝和靶向PCR，他們獲得了一個大小29891 bp的冠狀病毒基因組，它與SARS-CoV BJ01（GenBank登錄號AY278488.2）具有79.5％的序列一致性（sequence identity）。將這些1582個讀取片段與所獲得的基因組進行重新映射可取得較高的基因組覆蓋。這個基因組序列已被提交GISAID網站（登錄號EPI_ISL_402124）。根據世界衛生組織（WHO）的名稱，他們暫時將它稱為新型冠狀病毒2019（2019-nCoV）。隨后從其他四名患者中使用NGS和PCR獲得了另外四個2019-nCoV全長基因組序列（WIV02，WIV05，WIV06和WIV07）（GISAID登錄號EPI_ISL_402127-402130），彼此之間的一致性高于99.9％。

　　2019-nCoV基因組由冠狀病毒共有的6個主要的開放閱讀框（ORF）和一些其他的附屬基因組成（圖1b）。進一步的分析表明，一些2019-nCoV基因與SARS-CoV在核苷酸序列上的一致性低于80％。然而，用于冠狀病毒物種分類的開放閱讀框ORF1ab中的七個保守性復制酶結構域在2019-nCoV和SARS-CoV之間具有94.6％的氨基酸序列一致性，這意味著這兩者屬于同一病毒物種。

　　他們隨后從蝙蝠冠狀病毒BatCoV RaTG13中發現了一個短的RdRp區域，這個區域之前在云南省的中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）中檢測到，它與2019-nCoV具有高度的序列一致性。他們對這種RNA病毒樣本（GISAID登錄號EPI_ISL_402131）進行全長測序。Simplot分析顯示，2019-nCoV在整個基因組中與RaTG13非常相似（圖1c），全基因組序列一致性為96.2％。

　　通過使用2019-nCoV、RaTG13、SARS-CoV和先前報道的蝙蝠SARSr-CoV的比對基因組序列，在2019-nCoV基因組中未檢測到重組事件發生的證據。對全長基因組、RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）基因和S基因序列的系統進化樹分析均顯示RaTG13與2019-nCoV存在最密切的親緣關系，與其他SARSr-CoV形成不同的譜系（圖1d）。2019-nCoV的編碼受體結合蛋白---刺突蛋白（S）---的基因除了與RaTG13的S基因具有93.1%的核酸序列一致性外，與其他冠狀病毒高度不同，與所有先前描述的SARSr-CoV的核苷酸序列同一性低于75％。2019-nCoV的S基因和RaTG13的S基因比其他SARSr-CoV要長。與SARS-CoV相比，2019-nCoV的S蛋白的主要區別是N末端結構域中的三個短插入序列和受體結合基序中的5個關鍵氨基酸殘基有4個發生了變化。2019-nCoV的S蛋白在N末端結構域的插入序列是否具有像MERS-CoV那樣的唾液酸結合活性需要進一步研究。2019-nCo與RaTG13存在密切的系統進化關系為2019-nCoV起源于蝙蝠提供了證據。

　　他們基于S基因的受體結合結構域（不同冠狀病毒基因組中變化最大的區域）快速開發了一種qPCR檢測方法（圖1c）。他們的數據顯示，針對這種檢測方法設計的引物可以將2019-nCoV與所有其他人類冠狀病毒（包括與SARS-CoV存在95％一致性的蝙蝠SARSr-CoV WIV1）區分開。在這7例患者中，他們在針對qPCR和常規PCR測試的首次采樣期間，在6個BALF樣本和5個口腔拭子樣本中檢測到2019-nCoV陽性。但是，在第二次采樣期間，他們在來自這些患者的口腔拭子、肛門拭子和血液中不再檢測到2019-nCoV陽性（圖2a）。他們必須指出，包括RdRp或E基因在內的其他qPCR靶標可能用于常規檢測。基于這些發現，他們認為這種疾病應當通過呼吸道傳播，但是如果將研究擴大到更多的患者，他們不能排除其他的傳播可能性。

　　為了對2019-nCoV進行血清學檢測，他們使用了先前開發的蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣殼蛋白（NP）作為IgG和IgM ELISA測試中的抗原，這種核衣殼蛋白與2019-nCoV的核衣殼蛋白具有92％的氨基酸一致性，結果表明與除了SARSr-CoV之外的其他人類冠狀病毒不存在交叉反應。作為研究實驗室，他們只能從這7名病毒感染患者中獲得了5個血清樣本。他們在疾病發作后的第7、8、9和18天監測了其中的一名患者（ICU-06）的病毒抗體水平，結果觀察到明顯的IgG和IgM抗體滴度增加趨勢（在最后一天下降）（圖2b）。在第二項實驗中，他們在疾病發作后約20天左右對這7例病毒陽性患者中的5例進行了病毒抗體檢測。所有患者樣本而不是健康人樣本，均顯示較強的病毒IgG陽性（圖2b）。他們還發現了三個IgM陽性樣本，這表明是急性感染。

　　他們隨后使用了來自ICU-06患者的BALF樣本在Vero細胞和Huh7細胞中成功分離出了這種病毒（名為2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019，下稱毒株WIV04）。在培養三天后，在細胞中觀察到明顯的致細胞病變作用。通過使用交叉反應性病毒核衣殼蛋白抗體進行免疫熒光顯微鏡檢查、通過宏基因組測序表明它的大多數讀取序列可映射到2019-nCoV以及qPCR測試表明病毒載量從第1天到第3天發生增加，毒株WIV04的身份在Vero E6細胞中得到了驗證。

　　在電子顯微鏡下，受感染細胞的超薄切片中的病毒顆粒顯示出典型的冠狀病毒形態。為了進一步確認病毒IgG陽性樣本的中和活性，他們使用5個IgG陽性患者血清在Vero E6細胞中進行了血清中和測定。他們證實所有血清樣本均能夠以1：40～1：80的稀釋度中和120 TCID50 2019-nCoV。他們還發現，這種病毒可以在1:80的稀釋度下被馬抗SARS-CoV血清交叉中和，但與SARS-CoV抗體交叉反應的潛力需要通過人抗SARS-CoV血清加以驗證。

　　血管緊張素轉化酶II（ACE2）被認為SARS-CoV的細胞受體。為了確定2019-nCoV是否也將ACE2作為細胞進入受體，他們使用表達或不表達人類、中華菊頭蝠、果子貍、豬和小鼠的ACE2蛋白的HeLa細胞進行了病毒感染性研究。他們發現2019-nCoV能夠使用除小鼠ACE2以外的所有其他物種的ACE2蛋白作為表達ACE2的細胞中的進入受體，但在不表達ACE2的細胞中不會如此，這表明它很可能是2019-nCoV的細胞受體（圖3）。他們還證實2019-nCoV不使用其他的冠狀病毒受體：氨基肽酶和二肽基肽酶4。

　　這項研究提供了關于2019-nCoV的第一份詳細報道，其中2019-nCoV是造成中國中部武漢市正在發生的急性呼吸道綜合征疫情的可能病因。在所有測試的患者中觀察到的病毒特異性核苷酸陽性和病毒蛋白血清轉化提供了這種疾病與這種病毒的存在之間存在關聯性的證據。但是，仍然有許多緊急問題需要解決。尚未通過動物實驗來證實2019-nCoV與這種疾病之間的關聯性以充分符合科赫法則（Koch's Postulates）。他們還不知道這種病毒在宿主之間的傳播途徑。這種病毒似乎在人與人之間傳播的可能性越來越大了。我們應當密切監視這種病毒是否繼續演變成更強的毒性。由于缺乏特異性治療，并考慮到SARS-CoV與2019-nCoV之間的相關性，一些針對SARS-CoV的藥物和臨床前疫苗可能可以用于抵抗這種病毒。最后，考慮到SARSr-CoV在它們的天然病毒庫中的廣泛傳播，未來的研究應當集中在更廣泛的地理區域對它們進行主動監視。從長遠來看，應當為這類病毒引起的未來新興傳染病準備廣譜抗病毒藥物和疫苗。最重要的是，應對野生動物的馴養和消費制定嚴格的法規。