法醫ＤＮＡ檢測平臺的研究進展與比較研究

法醫 ＤＮＡ檢測平臺的研究進展與比較研究

摘要：現代科學技術帶動了 ＤＮＡ檢測技術在法醫領域的不斷發展．以目前世界上比較先進的三個 ＤＮＡ檢測平臺為例，探討法醫 ＤＮＡ檢測平臺的研究與應用．每項技術有其優缺點，在實際的法醫 ＤＮＡ檢 測中，要靈活地選用檢測平臺，以促進工作的順利開展．

近幾年來，中國社會刑事犯罪率不斷上升，造成極緊張 的社會氛圍．加強刑事案件偵破手段，成為現在依法治國的 重要內容．ＤＮＡ檢測技術作為一項能夠準確識別生物特征的 技術，為法醫學鑒定提供了科學的依據，因此也成為現代最 重要的刑事技術手段． 我國刑事偵破對 ＤＮＡ檢驗技術的應用是逐年遞增，截 至 ２０１５年，公安機關在辦案實踐中，利用 ＤＮＡ檢測技術識 別 ７０余萬涉案人員，認定 ８１萬余起各類刑事案件，另外鑒 定被拐賣、失蹤兒童 ４９００人．ＤＮＡ檢測技術的引用，嚴厲打 擊了刑事犯罪，極大維護社會穩定．因此一直得到世界法醫 界的重視．尤其是對法醫 ＤＮＡ檢測平臺研究與應用，各國都 設立專門的研究組織與部門，縱向挖深 ＤＮＡ檢測技術．以美 國為主的發達國家，不斷推出新的 ＤＮＡ檢測技術，比如新款 ＡＢＩ３５００遺傳分析儀、采用微流控技術快速 ＤＮＡ檢測儀以及 ＮＧＳ新一代（二代、三代）測序平臺等．二代測試平臺已經在 發揮重大的法醫 ＤＮＡ檢驗作用．公安部在“十一五”中首次 使用我國成功研發的首臺法醫 ＤＮＡ檢測平臺，打破了國外 技術壟斷．隨后的“十二五”“十三五”期間，警察機關緊跟國 際水平，引領我國法醫 ＤＮＡ檢測平臺研究與應用． １　ＧＡ１１８系列法醫 ＤＮＡ遺傳分析儀的研究發展 （１）在 ２０１２年左右，美國 ＦＢＩＣＯＤＩＳ把 ＳＴＲ位點從 １３ 個增加到 ２０個，利用六色熒光光譜處理技術，提升了識別個 體與親緣復雜關系的能力［１］ ．基于新增的 ＳＴＲ位點檢測，公 安部法醫研究所也開始對 ＧＡ１１８系列法醫 ＤＮＡ遺傳分析儀 的光譜分析技術進行升級研究，校正空間、光譜，優化 ＳＴＲ數 據的預處理與質量評價流程．從五色增加到六色的技術算法 系統，相應增加同個電泳通道能夠檢測的顏色．因此六色熒 光屏技術對于 ＤＮＡ檢測技術的綜合發展具有重要意義，體 現軟硬件與試劑耗材性能的良好結合．六色熒光光譜處理技 術工作有四個環節：１）依據需要檢測樣本，選擇、設計具有六色試劑體系 ＳＴＲ工作模型，規劃 ＤＮＡ檢測平臺階段程序的 動作程序；２）參照六色試劑燃料情況，查找光譜分布矩陣，分 析逆運算，并使用事前算法校矩陣；３）發送命令集，儀器硬件 平臺接收后，對六色 ＳＴＲ數據進行采集，并依據實時基線進 行校正處理；４）對 ＳＴＲ數據進行綜合檢測，全面分析處理文 件信息、光校正信息、樣本信息、運行信息等，將含有六色試 劑 ＤＮＡ數據信息以 ＦＩＤ、ＡＢＩＦ的數據格式輸送出來． 依照上面步驟進行 ＤＮＡ測試，最終得出，六色 ＤＮＡ熒 光光譜中的數據信息，是可以被 ＧＡ１１８系列法醫 ＤＮＡ遺傳 分析儀準確采集．并通過光譜矩陣建模，精確分析 ＳＴＲ熒光 光譜．利用分析儀呈現出六色熒光光譜的情況，實現識別個 體生物特征與復雜的親緣關系． （２）ＤＮＡ遺傳信息庫的規模不斷擴充龐大，ＤＮＡ數據對 于刑事偵查的作用也在不斷加大．一系列中高通道系列的 ＤＮＡ遺傳分析技術應運而生，ＰＣＲ體系就是其中一例．ＰＣＲ 體系的初衷就是為減少在龐大的 ＤＮＡ數據庫中的檢測時 間．為處理這項難題，公安部法醫研究所以 １６通道毛細管電 泳 ＤＮＡ遺傳分析儀為技術基礎，創新研究 ２４、９６中高通道 法醫 ＤＮＡ遺傳分析儀．如果說 ＧＡ１１８系列的 １６Ａ法醫 ＤＮＡ 遺傳分析儀是技術與材料的綜合，２４、９６中高通道法醫 ＤＮＡ 遺傳分析儀則是系統的綜合，引進激光誘導技術，構建熒光 檢測系統，并且對進樣、恒溫、數據輸送與處理等系統，都進 行一定的更新，整體性提高了遺傳分析儀技術．以 ＧＡ１１８－ １６Ａ為原型，２４、９６中高通道遺傳分析儀器，使用小體積、低 耗能、壽命更長的固體激光器，淘汰了氬離子氣體激光器，提 高激光傳輸系統的工作效率．熒光光譜檢測系統上，長波通 濾光片具有大視野場角，準直孔徑更大，可以鏡頭成像，配備 ５１２５１２制冷 ＣＣＤ，保證技術的均勻性，可以檢測寬光譜范 圍熒光光譜；恒溫系統上，引進格柵與 ３Ｄ均勻循環恒溫技 術，優良創新風道設計，提高熱傳導與溫控系統的工作效率，實現了體積增大、靈敏度提高的系統目標；在 ＳＴＲ數據軟件 系統上，利用先進 ＣＣＤ驅動時序電路設計，采用嵌入式電路 設計，完善 ＣＣＤ數據采集電路，強化采集與傳輸空間、數據 的方法，對空間、光譜、ＳＴＲ數據采集算法進行更加嚴格地校 正．因此，從整個系統上進行分析，２４、９６中高通道遺傳分析 儀具有全面的改進，盡管現在這兩種 ＤＮＡ檢測平臺在法醫 實踐中并未正式使用，但是 ２４通道 ＤＮＡ遺傳分析儀已經完 成原樣試機，９６ＤＮＡ遺傳分析儀則正在進行系統調試． （３）ＤＮＡ遺傳分析儀只是在技術層面完成了 ＤＮＡ數據 檢測工作，對于數據的分析，另外還有評判專家系統．與 ＧＡ１１８系列法醫 ＤＮＡ遺傳分析儀同步發展起來，ＤＮＡ遺傳 數據評判專家分析系統與其同軌而行，緊密相連，也是刑事 偵查員分析 ＤＮＡ遺傳信息數據的平臺．ＤＮＡ遺傳信息數據 評判專家系統，直接得出 ＤＮＡ遺傳信息的結論，常用在法醫 與鑒定親緣關系、染色體與 ＤＮＡ異常診斷、ＳＮＰ分裂等方 面．但是，我國 ＤＮＡ遺傳數據評判專家分析系統起步相對較 晚，在國家“十一五”期間，公安部物證鑒定中心開始研究 ＤＮＡ分析技術，取得良好成就． 公安部法醫研究所加深研究六色試劑 ＤＮＡ數據分析技 術，核心部分有：Ｌａｄｄｅｒ分型參照系建立方法、ＤＮＡ分型質量 評價方法、ＳＩＺＥ內標的定標方法與 ＤＮＡ分型質量評價方法， 分別取得重大的研究成果．以相關試劑體系為基礎，完善六 色 Ｌａｄｄｅｒ分型參照系，在技術上實現定長 ＤＮＡ片段，提升基 因分型數據處理技術． 在六色試劑 ＳＩＺＥ定標上，ＧＡ１１８系列遺傳分析儀建立 了完整的六色光譜數據的 Ｓｉｚｅ基線調整、譜峰識別、標準譜 峰序列匹配、ＳＩＺＥ定標、ＳＩＺＥ質量評價流程；在 Ｌａｄｄｅｒ分型 參照系上，ＧＡ１１８系列遺傳分析儀基于 Ｐａｎｅｌ、Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｎ參 考數據，重構了六色試劑體系 Ｐａｎｅｌ、Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｎ，實現了實際 六色試劑體系的 Ｌａｄｄｅｒ譜峰位置和參考 Ｌａｄｄｅｒ位置的正確 匹配；在 ＤＮＡ樣本分型上，ＧＡ１１８遺傳分析儀采用前面步驟 生成的六色 Ｌａｄｄｅｒ分型參照系，成功實現了 ９９４７標準品和 實際 ＤＮＡ案件樣本的 ＳＴＲ分型，在技術上實現六色熒光光 譜試劑體系的 ＤＮＡ片段定長和基因分型數據處理． ２　微流控快速 ＤＮＡ分析儀的研發 法學證據的搜集比較重視及時性與現場性，這促使發達 國家研發新的 ＤＮＡ檢測平臺，以微流控技術為基礎研發的 ＤＮＡ檢 測 儀 即 是 最 好 平 臺．美 國 ＩｎｔｅｇｅｎＸ公 司 研 發 的 ＲａｐｉｄＨＩＴ２００就是利用微流控研發出的具有代表性的 ＤＮＡ 檢測儀器． ＲａｐｉｄＨＩＴ２００結合 ＭＯＶｅ流體集成技術與流控芯片，更 迅速地處理血拭子樣品與咽拭子．利用一次性的芯片匣，該 系統可單次以對 ４－８個拭子樣品進行處理，在 ９０分鐘內生 成 ＣＯＤＩＳ兼容的結果．整機相對緊湊，重量約為 ８１．５ｋｇ，尺寸為 ４８ｃｍ×７３ｃｍ×７１ｃｍ．樣品細胞在芯片上進行裂解后，使 用磁珠對其中的 ＤＮＡ進行提取和純化，完成 ＳＴＲ位點擴增， 最終產物在芯片外的毛細管進行電泳分離． 進行 驗 證 測 試 時，美 國 ＧＥ和 Ｎｅｔｂｉｏ公 司 合 作 的 ＤＮＡＳｃａｎ系統測試結果，相比 ＲａｐｉｄＨＩＴ更加接近．ＢｉｏＣｈｉｐＳｅｔ 匣不僅整合了樣品提取和擴增用的微流控芯片，也集成了毛 細管電泳芯片． 對于快速 ＤＮＡ檢測系統的設計，公安部也利用微流控 技術加大對其研究，設計版塊主要有四個：樣品處理、分離、 檢測、分析．利用微流控技術處理樣品，與原來 ＤＮＡ檢測系 統大不相同，也是整個 ＤＮＡ檢測系統的核心部分．輸入系統 樣本為拭子，快速裂解細胞、提取 ＤＮＡ、擴增位點、檢測分離， 最后輸出 ＳＴＲ位點的數據信息．選擇樣本數目在 ５至 １６個 之間．既可以滿足實際需要，又能節約儀器成本． 處理模塊具備核心的微流控芯片，在設備配套上也比較 齊全，包括氣壓、溫度控制系統與樣品儲存系統．使用塑料芯 片就可以，既方便加工，又可降低成本，常用的是聚丙烯、共 聚物、環烯烴聚合物．芯片當中有液體與氣體管路，具有多層 化，以氣路的正負電壓控制閥門開閉，實現流體控制技術．進 行毛細血管電泳時，以高壓電源與溫控原件實現快速的溫度 控制，制造緊湊的儀器體積環境，縮短分離時間． 拭子上的細胞經過充分的裂解后，使用磁珠或者硅膠柱 進行分離純化，洗脫后進行若干個 ＳＴＲ位點的多重 ＰＣＲ擴 增．芯片上的 ＰＣＲ擴增的體積通常不超過 １０μＬ，方便實現快 速的變溫．同時選用快速的 ＰＣＲ酶，最終將傳統的超過 ２個 小時的 ＰＣＲ反應縮短到 ３０分鐘內．擴增產物在分離系統中 進行毛細管電泳． ３　ＮＧＳ新一代 ＤＮＡ測序儀 在法醫學應用上，ＮＧＳ新一代測序技術可謂大展手腳， 在近幾年迅速發展起來，同時被法醫界稱為“深度測序技 術”，“第二代測序技術”． ＮＧＳ新一代測序技術近幾年的應用領域非常廣，其擺脫 傳統電泳的技術，具有高通量的技術特點．相比上一代，ＮＧＳ 新一代測序技術邊合成邊測試的工作方法，可以對 ＤＡＮ數 據實時監測，避免操作時間過長出現過度變化的情形．其中， 具有代表性的包括基于焦磷酸測序的 ４５４測序技術（檢測化 學發光），ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ測序技術（檢測微小的 ｐＨ變化），基于 連接酶測序的 ＳＯＬｉＤ技術和 ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ技術，基于單 分子聚合酶延伸過程檢測的 Ｈｅｌｉｃｏｓ技術 和 ＰａｃＢｉｏ技術以 及目前占據最主要地位的基于熒光標記和可逆保護集團的 聚合酶延伸的 Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ技術［２］ ．這些技術大大提高測 序通量和速度，同時顯著降低了測序成本．這些技術不僅在 醫療和生命科學研究得到了應用，也在法醫鑒定，農業、畜牧 業育種，現代生物育種等方面發揮了重要作用．ＮＧＳ新一代測序技術一直是法醫學領域關注的焦點．至 ２０１５年 ９月，相關的學術研究數量十分多，ＰｕｂＭｅｄ檢索的國 際學術論文數量已經達到 ２００多篇．美國產業界一直非常重 視對 ＮＧＳ新一代測序技術的研究，不斷對 ＤＮＡ檢測平臺進 行創新，增長法醫試劑盒，增加 ＤＮＡ檢測的初始量，達到 １００ｐｇ～１ｎｇ，能夠檢測 ２３１個 ＳＴＲ位點［３］ ． 這項技術很好地適應偵查機關對刑事證據偵查的要求， 在辨別與分析當事人 ＤＮＡ數據上及時便捷．因此法醫學領 域的關注度非常高．許多 ＤＮＡ技術發明公司，也在不斷地加 大對其研究與開發，發明出不同系統的檢測系統，不過也遇 到了一些相應問題．然而，不論怎么說，ＮＧＳ新一代測序技術 代表著一個發展趨勢． ＮＧＳ新一代測序技術的不同系統各有優劣，共同推動了 基于 ＮＧＳ新一代測序技術在法醫學上的應用．這類 ＮＧＳ新 一代測序平臺具備強大的 ＤＮＡ測序數據生產能力，采用多 重測序的辦法提高 ＤＮＡ測序質量，在法醫學應用上可給出 更加豐富的 ＤＮＡ序列信息，在降解 ＤＮＡ分型、復雜混合樣 本解析、復雜親緣關系鑒定、表型推斷等法醫 ＤＮＡ應用領域 具備優勢．同時，ＮＧＳ新一代測序技術在法醫 ＤＮＡ領域廣泛 應用還要面臨一些挑戰：１）基于 ＮＧＳ新一代測序技術的法 醫 ＤＮＡ檢測平臺儀器、試劑耗材還非常昂貴，需要進一步降 低成本；２）基于 ＮＧＳ新一代測序技術的法醫 ＤＮＡ檢測平臺 產生的數據量非常大，相關數據信息處理需要較強大的計算能力，存儲和管理需要更多的硬件支持［４］ ． ４　結語 法醫 ＤＮＡ檢測平臺在科技發展形勢中，肯定還會有新 的突破．盡管目前 ｓａｎｇｅｒ測序技術是目前法醫檢測平臺的黃 金標準，代表現在國際最高水平，但是在未來法醫領域，ＳＴＲ 位點數量會不斷增多，ｓａｎｇｅｒ測序技術同樣也會面臨挑戰．因 此，要促進法醫 ＤＮＡ檢測平臺不斷走向完善，更好地服務于 刑事證據的鑒定識別，打擊刑事犯罪，發揮現代技術的社會 治理功能．ＤＮＡ檢測技術的進一步完善，也是需要相關技術 人員與廣大社會公民的不懈努力．