DNA檢測技術的應用,為法醫學帶來了一場技術革命。通過對遺傳物質DNA的序列多態性及長度多態性的檢驗,即可實現個體識別及親權鑒定,該技術正在成為當前法醫物證鑒定最主要的技術手段。以法醫DNA檢測技術的產生、分類為綱,綜述了我國在該領域的研究現狀,最后對法醫DNA檢測技術的發展方向進行了展望。
十年前的5月7日,中國民航北方航空公司一架麥道82飛機在大連附近海域墜毀。在善后處理中,曾有以下報道:
“空難者親屬最關心的問題就是盡快辨認親人。為了保證辨認準確無誤,所有打撈上來的遺體的肌肉顆粒樣品和空難者家屬的血樣都以最快的速度送到沈陽進行DNA鑒定。檢測相當復雜,首先提取DNA,然后進行體外克隆放大識別其特征,之后再進行DNA數字化處理,輸入計算機比對,最后找出遺體和其家屬之間的DNA對應關系,才能最后確定遺體的身源……”
報道中提到的“DNA鑒定”就是被公安機關稱為偵查破案“劍之鋒刃”的法醫DNA檢測技術。人體細胞中含有約30億個堿基對的DNA,每個人的DNA都不完全相同,不同的堿基對數目達幾百萬之多,因此通過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也因人而異。法醫DNA檢測技術就是通過對遺傳物質DNA的序列多態性及長度多態性的檢驗來進行法醫學的個體識別及親權鑒定。如今,該技術在偵查破案、查找被拐賣兒童和無名尸源、死亡案件個體識別以及證實犯罪等方面發揮了顯著作用,已成為法醫物證檢驗的常規技術, 為打擊違法犯罪提供了強有力的武器。
法醫DNA檢驗技術的研究和分析對象主要是生物體內DNA的多態性。一般來說,基因或非編碼區的DNA標記在染色體上的位置稱為基因座,而位于同一個基因座上不同序列的基因被稱為等位基因。DNA多態性就是指作為遺傳標記的基因座存在多個等位基因,分析基因座上等位基因的差異就是實現同一認定的生物學基礎。
人類基因組DNA多態性源于基因組DNA中的堿基突變,變異后的基因遺傳給子代,顯示出DNA分子水平上的個體差異。DNA多態性可分為兩類:一類表現在特定基因座上相關序列長度上的個體差異,叫長度多態性;另一類表現在特定基因座上堿基序列的個體差異,叫序列多態性。長度多態性多存在于基因組DNA中的一類串聯重復序列,其串聯重復單位(核心序列)數目在人群中存在較大差異,具有高度多態性,稱此重復為可變數目串聯重復序列(VNTRs);根據重復單位長度,分為二類:重復單位長度為10~70bp,稱為小衛星;長度為2~6bp的,稱為微衛星,或叫STR。
按孟德爾遺傳規律,子代DNA的特定序列來自雙親, 即在同源染色體中,位于同一位置上的兩個等位基因,一個從母親處繼承,另一個從父親處繼承,這兩個等位基因可相同也可不同。這種符合孟德爾遺傳規律、具有個體特異性的DNA多態性便是進行個體識別和親子鑒定的理論基礎。
法醫DNA檢驗技術經歷了多位點DNA指紋圖分析技術、擴增片段長度多態性分析技術(AMP-FLP)、線粒體DNA檢測技術三大技術革命。目前已發展到以熒光標記多基因座STR復合擴增檢測技術、線粒體DNA檢測技術和SNP分析技術為主導的技術體系。
“DNA指紋”或DNA分型(圖譜)由英國遺傳學家Alec Jeffreys在1985年首次提出,是出現最早的一種法醫DNA技術。DNA指紋屬于限制性片段長度多態性標記(RFLPs)。利用可以識別和切斷特異DNA序列的限制性內切酶,將人類DNA切割成不同長度的DNA片段,經電泳分離后,用Southern印跡將酶切片段轉移到尼龍膜或硝酸纖維膜上,用帶有熒光或放射性同位素標記的特異性探針進行雜交,檢測出不同長度的DNA片段,即得到該限制性內切酶及特異性探針的DNA圖譜。DNA指紋圖技術根據所使用的探針不同可分為多位點與單位點,其主要差別是多位點探針由于同時檢測多個位點,DNA指紋圖譜譜帶多,形成的多基因座RFLP圖譜被稱為DNA指紋;而單位點探針由于檢測單個位點,DNA圖譜只出現一條帶(純合子)或兩條帶(雜合子),通常將這種單基因座RFLP圖譜稱為DNA紋印。DNA指紋雖然可以進行同一認定和判定親權關系,但卻存在著一些局限性,如方法繁雜、周期長、實驗條件高等,這些局限性的存在使得DNA指紋技術不太符合司法鑒定的要求,故沒有得到更大的發展與普及。
1985年,美國Cetus公司的Mulis.KB等人創立了聚合酶鏈式反應(PCR)技術。該技術是一種快速的體外擴增特殊DNA序列片段的技術,它能在短時間內復制成百上千的目標DNA序列,獲取足夠量的特異性片段,以供DNA的進一步分析。該技術根據VNTR基因座側翼序列,設計、合成與側翼互補的寡核苷酸作為PCR引物,應用PCR技術擴增包含VNTR基因座側翼和重復單位的序列,最后通過凝膠電泳分離不同片段長度的擴增產物,根據擴增片段長度差異確定其基因型。因此,這種用PCR技術檢測VNTR基因座多態性的技術被稱為擴增片段長度多態性(AMP-FLP)分析; 它充分發揮了兩個優勢:一是基因組VNTR基因座具有高度多態性優勢,二是PCR快速、高效擴增的優勢。AMP- FLP分析是20世紀90年代法醫DNA分析技術的一項突破性進展,使DNA分型實現了高效、快速、靈敏的目標,被稱為第二代DNA分型技術[2]。
法醫學鑒定應用AMP-FLP具有以下幾個特點[3]: DNA需要量少,檢測效率高,適用于陳舊、降解、腐敗檢材;可進行多個基因座復合擴增檢測;具有種屬特異性;能進行混合檢材的個體識別;可獲得不連續的等位基因頻率; 實驗周期短,可靠性好,重復性高;操作相對簡單。但該技術也存在著一些缺陷,如VNTR擴增片段長度相對較長,靈敏度較STR低;等位基因片段間長度相差很大,易產生較小等位基因優先擴增現象;若DNA嚴重降解,較大的等位基因可能擴增失敗等。
1988年,Saiki等人首次發現人類基因組存在一些短串聯重復片段(STR),這些序列能用PCR擴增且具有高度多態性[1]。STR位點因其PCR產物片段長度短、DNA分子組成結構簡單、PCR反應中引物與模板退火溫度相似等特點,為對多個STR位點復合擴增檢測提供了條件。90年代中后期,隨著現代化DNA檢測設備DNA測序儀的問世,使應用熒光染料標記引物的方法對多個STR位點同步檢測分析成為現實。這種檢測技術通過同時檢驗多個STR位點獲得足以認定個體的遺傳信息,被稱為熒光標記多基因座STR復合擴增檢測技術[4]。該技術首先在擴增引物上附上熒光發光基團, 當帶有發光基團的DNA片段經過激發光照射區時發出對應波長的熒光,該熒光光譜信息被光電檢測器采集后,由電子系統及計算機進行儲存并處理。通過比對樣品光譜信號與標準比對品(標準比對品是一系列大小不同但長度已知的DNA片段)信號出現時間,計算出相應DNA片段的長度大小,從而得到檢測結果。然后,根據熒光的光譜范圍,檢測結果參照所擴增位點的全等位基因混合物,就能知道所檢測到的DNA片段等位基因命名,記錄下來就是該樣本在該位點下的DNA分型。
STR基因座具有以下適宜于法醫DNA檢驗的特點: STR多態性基因座數量多,片段長度一般小于400bp,易于擴增,適于微量檢材的檢驗;等位基因大小比較接近,較小等位基因優先擴增不明顯;不同位點的STR基因座片段長度差異較小,便于復合擴增,提高檢測效率。此外,STR基因座分析方法簡便、判型準確,分型程序明確、規范,所得分型結果圖形簡單,便于實現DNA分型標準化和自動化,便于分型數據的計算機儲存、聯網檢索。目前,STR技術已經是法醫學中應用范圍最廣泛,使用頻率最高的DNA分型技術[5]。
線粒體DNA(mt DNA)是人類第二套基因組DNA,其突變率較高,且多集中于D環區中的高變區域,無母系親緣關系個體間線粒體DNA高變區堿基組成序列差異顯著,集中對該高變區進行序列測定即可達到對檢材的個體來源認定。它由母系遺傳,已有數據表明,四代之內所有母系親屬的線粒體序列相同,因此可用于母子鑒定[6]。
檢測線粒體DNA的多態性需用測序技術,法醫DNA實驗室最常用的是熒光染料標記全自動測序技術:利用DNA聚合酶對樣品DNA進行PCR擴增,采用標記引物或標記終止物雙脫氧核苷酸的方法使擴增產物帶上熒光,在全自動測序儀上檢測,從而得到所測序列的堿基排列順序。
由于人體的每個細胞中均有含有成千上萬的線粒體細胞器,因此其內部的DNA拷貝數比核DNA多許多倍,在檢測上具有更高的靈敏度。其閉環結構具有抵抗降解能力。因此,可以進行陳舊、腐敗檢材的檢測;在一些角化的細胞,如毛干、指甲等含有角化的細胞,細胞核DNA大部分已降解,前述各種檢測方法已無法檢測,但線粒體仍然存在,線粒體DNA檢測技術可以實現這類檢材的人體遺傳分析與親子鑒定,這是該技術的最大優點。但在法醫檢驗中還存在以下問題[7]:由于其靈敏度高,增加了污染的危險性,需要嚴格控制污染;由于其為母系遺傳,不能區分開來自同一母系的個體和進行父權鑒定;其序列分析方法復雜、繁瑣,工作量大,費用昂貴、出錯率高。
單核苷酸多態性是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性,這種變異可由單個堿基的轉換或顛換所引起,也可由堿基的插入或缺失所致,但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。它是人類基因組中最常見、分布最廣泛的DNA多態性類型,占所有已知多態性的90%以上。雖然SNP多態信息不如多等位基因的STR (SNP只有兩個等位基因和三種基因型),但分布的高密度性彌補了這一不足。SNP是一種早期突變,較STR等多態性遺傳標記具有更高的遺傳穩定性。因此,SNP可用于人類起源、進化、遷移的研究,也非常適用于法醫個體識別和親權鑒定。SNP比重復序列更易進行PCR擴增,而且沒有基因漏擴和影子帶現象,有利于基因分型。由于SNP是二態的, 易于自動化批量檢測,易于計算機分析結果、確定基因頻率。因此,SNP尤其適用于高度腐敗、降解、陳舊的法醫生物檢材,一些學者將其稱為第三代分子標記[8]。
SNP的檢測方法很多,在眾多方法中,對待檢測片段進行直接擴增、測序是最為準確的方法。近年來隨著技術的發展,采用了微陣列DNA芯片[9]、飛行質譜分析和變性高效液相層析法等非電泳分型技術,大大加快了SNP檢測效率。
以上技術方法奠定了法醫DNA檢驗分析的堅實基礎, 隨著各種新檢驗技術的逐步建立、遺傳標記的漸次增加、提供信息類型的擴大、涉及理論的更加深入和完善,法醫DNA檢測技術將會持續不斷地得到發展。
我國法醫DNA檢驗技術的研究基本與國際同步,自1985年國際上首次報道DNA指紋技術應用于法醫鑒定以來,公安部物證鑒定中心等國內相關單位便開始了此項研究。“七五”后期,我國首次把DNA指紋技術應用于辦案,開啟了我國法醫DNA檢驗的新時代。“八五”期間,我國緊跟國外發展,建立了檢測DNA擴增片段長度多態性[12]和測定人類線粒體DNA序列多態性的方法;“九五”期間,商品化DNA檢驗試劑盒和自動測序儀的出現,一次即可完成16個STR多態性位點的檢驗,大大提高了個體識別率,達到了同一認定的水平。與此同時,我國開始研制國產DNA檢驗試劑盒;“十五”期間,公安部物證鑒[13]定中心成功研制了國產DNA熒光試劑盒,推動了STR技術在公安一線的普及應用;“十一五”期間,公安部物證鑒定中心和公安部第一研究所分別開展了疑難檢材檢驗研究、提取技術與試劑研究、法醫DNA專用檢測設備研究、DNA分析軟件研究和檢測消耗品的研究。這些研究大大推進了我國法醫DNA檢測技術的發展,使我國的法醫DNA檢測技術進入了世界先進行列。
人類遺傳標記已經從第一代的限制性酶切片段長度多態性(RFLP)系統、第二代的短串聯重復序列(STR)系統,發展到第三代的多態性標記單核苷酸多態性(SNP)系統。其中,第一代遺傳標記由于其檢測流程操作繁瑣,方法難以標準化,在法醫學上已趨于淘汰[14]。
STR是法醫DNA鑒定中最為常用的遺傳標記。常染色體STR復合熒光多重PCR分型技術已經成為一項國際法醫學界不可或缺的、公認的重要親權鑒定技術手段并已積累了成熟的經驗。我國采用STR檢驗技術,建成的全國DNA數據庫的DNA數據量已超過1700萬份。然而STR、SNP等經典遺傳學標記在同卵雙生子的法醫學個體甄別、二聯體親權鑒定等案例中具有一定的局限性,且STR基因座存在著較高的突變率[15]。上述問題促使法醫物證工作者致力于尋找新的更為穩定的遺傳多態性標記。目前,正在研究的可用于法醫學的遺傳標記除SNP外,還有插入缺失多態性標記(In De l)、Alu重復序列、DNA甲基化表觀遺傳標記等。
( 1) In Del作為一種特殊的二態性遺傳標記,與SNP具有相近的自然突變率,其突變率顯著低于STR。同時,In Del的兩個等位基因表現為片段長度多態性,使其可以采用目前法醫DNA鑒定領域常用的復合熒光多重PCR聯合毛細管電泳分型技術進行分型檢測,因而成為法醫DNA鑒定關注的熱點[16]。國內趙書民等成功建立了一個包含30個In Del位點和Amelogenin性別鑒定位點的復合熒光多重PCR擴增體系In Del_typer30,為In Del標記在中國人群中的應用奠定了一定的基礎[17]。
(2)Alu重復序列是靈長類動物基因組中短散在重復序列(SINE)家族的一員[18],Alu是人類最活躍的遺傳元件之一,從靈長類動物進化的早期開始,Alu元件通過逆轉錄轉座機制在基因組內快速擴增,目前在單倍體基因組中重復高達100萬次,約占整個基因組的10%以上[19]。由于這種DNA序列中含有限制性內切酶Alul識別的序列AGCT,所以稱為Alu重復序列。典型的人類基因組Alu序列長282bp,由兩個同源但有差別的亞基構成。在所有已知的基因內含子中,幾乎都發現了Alu序列。基于Alu元件的普遍性、多樣性和特異性,在法醫學領域,根據Alu元件的特點設計了眾多的技術方案,用于DNA定量、種屬鑒定、種族鑒定、性別鑒定、親子鑒定、全基因組擴增等[20,21]。
(3)DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳標記。新近研究[22]表明,DNA甲基化在二聯體親權鑒定、同卵雙生子法醫學個體甄別等可能有一定的應用前景,可作為STR或SNP等經典遺傳標記的有效補充。目前基于甲基化敏感的限制性核酸內切酶、重亞硫酸鹽轉化以及甲基化Cp G結合蛋白等原理,已建立一系列的DNA甲基化檢測方法,在法醫學實驗室具有一定的應用前景。通過對基因組范圍內的DNA甲基化掃描分析,科研人員正在研究具有潛在法醫學應用價值的DNA甲基化位點,有望依據甲基化的SNP位點進行個體識別,并減少所需要的SNP位點數[23]。
以上這些新的法醫DNA檢測方法,由于還缺少系統性的研究和成熟的應用體系,目前僅作為常規STR基因分型的補充檢驗技術,用于彌補STR檢驗中存在的不足。其中的SNP和In Del多態性檢驗技術,由于其本身的二態性特點, 更加適合DNA芯片等小型設備的檢驗,伴隨著第二代、第三代測序技術的迅速發展及相關標準和體系的建立,其檢驗時間有望大幅縮短,對應的檢測設備將更易于便攜,因此有望成為法醫DNA檢測的下一代主流技術。
目前,DNA片段長度多態性檢測的STR技術仍是當前國內外法醫DNA檢測的主要手段。STR技術至少在今后5年內還將保持技術主導地位,主要是因為:a. 技術原理成熟穩定;b. 相關技術資源豐富;c. 現有各國DNA數據庫均依此技術建立,庫存數據量巨大且在持續遞增,技術更替成本巨大;除非能得到與現有技術一致的結果,否則一系列新的遺傳標記或新的樣本分析模式要取代現有大規模數據庫中的數據,必須具有明顯的優勢和更低的成本。隨著法醫DNA檢測裝備的小型化、智能化,在現有大量STR DNA數據庫的基礎上,結合本文所述其它法醫DNA檢測技術, STR技術將進一步成熟和完善。當前,法醫DNA檢測方法和對應的檢測設備、試劑、耗材的研發將是法醫DNA檢測技術研究者面臨的兩大主要任務,二者相互支撐,共同促進法醫DNA檢測技術的持續發展。