活細胞RNA檢測一步輕松實現

　　一提到RNA的檢測，大家的腦海中可能會立即浮現出：RT-PCR、FISH、Northern blot等。的確，這些都是檢測RNA的經典方法，但它們需要裂解、固定、RNA抽提等，頗為繁瑣。其實，RNA的檢測完全可以更smart。默克密理博最新推出的SmartFlare? RNA“靈光”技術，只需一步孵育即可直接檢測活細胞內特異的mRNA或miRNA，不僅簡便，更可實現以往的方法所不能做到的突破性新實驗設計。

　　這種與眾不同的SmartFlare RNA檢測探針源自美國三院院士Chad Mirkin教授開發的NanoFlare技術。每個SmartFlare探針都是一個納米金顆粒，上面連接著多拷貝的雙鏈寡核苷酸序列：報告鏈和捕獲鏈。報告鏈上帶有熒光基團，在靠近納米金顆粒時，熒光淬滅。當目標RNA與納米金顆粒上的捕獲鏈結合時，報告鏈被釋放，上面的熒光基團會發出熒光，通過熒光檢測平臺檢測到。

　　原理就是這么簡單，實驗操作更簡單。在您的培養物中加入SmartFlare探針，孵育過夜，第二天檢測，OK。無需細胞裂解，無需RNA抽提和擴增，也無需轉染試劑。SmartFlare探針利用細胞自身的內吞機制進入活細胞，而且，在檢測完成后，探針可以從細胞中排出，不影響下游檢測。

　　如此smart的RNA檢測技術，難怪一上市就備受矚目。SmartFlare RNA“靈光”技術不僅被生物通讀者評為2013年度生命科學十大創新產品，也斬獲了兩項國際創新科技獎：The Scientist Top 10 Innovations 2013和The Analytical Scientist Innovation Awards 2013。如今，這項技術已經應用在細胞分選、干細胞分化發育研究等多個方面，也有不少文章發表。

　　突破性胞內標志物活細胞分選

　　傳統意義上的細胞分選是通過檢測細胞表面蛋白標記物來實現的，這需要使用熒光標記的抗體。不過，如果蛋白標記物在胞漿內，則不能通過這種方法分選，因為抗體染色的過程需要固定、透化等步驟。有時候可通過轉染入報告基因而達到分選細胞的目的，但是，這種方法可能會損害細胞的完整性，也可能擾亂細胞信號通路、干擾下游分析。之前由于只能局限于使用細胞表面標志物來分選細胞，大大限制了許多細胞分選的效率及純度，比如腫瘤干細胞的分選。

　　現在利用SmartFlare檢測試劑，我們能夠根據基因表達水平，或結合表面蛋白標記物，完成細胞的分選，并進一步增殖活細胞群體。這種技術在檢驗胞內的標記物時不需要固定或透化細胞，也不需要轉染試劑，讓細胞在分選后仍然保持完整。更重要的是，這種顆粒是惰性的，對細胞無害，而且檢測完成后SmartFlare顆粒會離開細胞，這意味著我們就能對分選出的細胞進行更多的生物功能研究。

　　這種根據RNA水平來檢測和分離細胞的能力為我們探索細胞功能打開了一扇新的大門，也讓我們能夠對傳統方法很難分選的細胞(如腫瘤干細胞)進行分選，并通過胞內標記物提高分選的準確性。

　　這一方面的應用成果已在著名期刊上發表。西北大學Feinberg醫學院的研究人員總結了近期的黑色素瘤研究成果，認為Nodal信號通路的重新出現意義重大，它有望成為預后標志物和治療靶點1。然而，Nodal是分泌蛋白，很難直接測定表達Nodal的黑色素瘤細胞的功能相關性。

　　他們認為，傳統技術(如免疫組化、Western blot和RT-PCR)雖然能夠測定Nodal的表達，但無法特異分選表達Nodal的亞群，用于進一步的功能研究。多虧有了特異針對Nodal mRNA的SmartFlare，黑色素瘤亞群的分選才得以輕松實現。這種方法最終鑒定出CD133在Nodal高表達的細胞中升高，有助于闡明 Nodal在黑色素瘤發展中的作用。