流式細胞術在血液學中的應用（五）

紅細胞疾病診斷

（一）網織紅細胞測定
    計數外周血中網織紅細胞數量,對于評價骨髓紅系造血及網織紅細胞從骨髓到外周血的轉送速率有重要意義。有核紅細胞在成熟過程中,脫去細胞核后仍有少量RNA殘留在細胞漿內,再經過約一天時間殘留RNA完全消失,成為成熟紅細胞。這種細胞漿內有殘留RNA的紅細胞稱作網織紅細胞。正常情況下有一定量的網織紅細胞出現在外周血中,正常值為1.0～1.5%,上限3.0%,但當紅細胞數異常時會出現錯誤結果。因此用網織紅細胞絕對值表示,正常值5～15×1010/L。由于常規方法測定須先在體外經活體染色(最常用亞甲蘭),然后在顯微鏡下計數,計數細胞數有限。用流式細胞儀測定網織紅細胞具有以下優點:①可避免由于細胞核的碎片或鐵幼粒細胞的顆粒的存在而出現假性網織紅細胞升高②可避免人為誤差③因為可在短時間內測量上萬個細胞,結果較常規方法準確、可靠,④同時可給出網織紅細胞年齡結構。
流式細胞儀測定網織紅細胞方法簡單,只須將紅細胞洗凈后用熒光染料染色后即可上機檢測。常用的熒光染料有焦寧Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。

（二）PNH診斷
陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）因血細胞膜上錨固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）減少或缺乏而導致與GPI有關的補體激活抑制因子如CD55、CD59減少或缺乏，因而紅細胞對補體異常敏感發生溶血。流式細胞儀檢查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59雙陽性細胞>95%，PNH病人CD55、CD59明顯減少，這種減少不僅表現在紅細胞上，粒細胞、淋巴細胞也有減少。已發現CD55c可能對GPI減少或缺乏較CD59更敏感。

 血小板功能分析和血小板病診斷

（一） 血小板功能分析
   血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發揮其功能的物質基礎，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類、含量、結構和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測定和分析血小板功能狀態。血小板質膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定可供分析血小板功能狀態，如CD62p、CD63正常血小板不表達，當血小板活化時表達明顯增加，可用來測定活化血小板。

（二）血小板病診斷攪
1．血小板相關抗體測定   血小板相關抗體可因不同機制產生。抗血小板自身抗體(包括原發性、藥物誘導產生、合并其它自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡)能引起嚴重的血小板減少。大多數原發性(免疫性)血小板減少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相關抗體的抗原仍不十分清楚,可能有多種,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗體也可能發生于多次輸血后或懷孕期間,這些自身抗體多為針對HLA-Ⅰ類抗原決定簇的抗體,一般是IgG,它們可迅速破壞和清除隨機供血者的血小板。因此能迅速測定這些抗體存在與否的方法是必需的。許多不同的利用放免、熒光、酶、SPA等的測定血小板抗體的方法已建立,但這些方法都很復雜、費時;同時給出的結果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗體來表示。近年來發展起來的用FCM測定血小板抗體的方法具有快速、簡便的優點,同時可測定血小板上和血清中的抗體;測定中FCM分析每一個血小板表面有無抗體,能給出血小板群體中有多少血小板表面有抗體(以%表示);同時能給出血小板相關抗體量與血小板數的直方圖,使我們了解血小板相關抗體在血小板群體中的分布情況。

FCM測定血小板抗體原理:分別用標有熒光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗體與分離洗凈的病人的血小板和在病人血清中孵育過的正常O型血小板作用后用FCM測定,前者測定的是病人血小板上的抗體后者測定的是病人血清中的抗體。
2．血小板無力癥   血小板無力癥時血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細胞儀測定不僅可測出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，還可測出GPIIb/IIIa減少程度，分類血小板無力癥。
3.巨大血小板綜合征（BSS）:血小板巨大, CD42a減少，CD42b減少，CD61 增加。

微小殘留白血病檢測

    微小殘留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病經治療后獲得完全緩解(Complete Remisson CR)后體內殘留少量白血病細胞的狀態。微小殘留白血病與明顯白血病(Overt leukemia)無明確界限,僅是白血病細胞負荷數量不同,一般成人明顯白血病時白血病細胞可達1012,經治療獲CR后≤1010,因此MRL狀態白血病細胞數可能是100-10攪。MRL是白血病復發的根源,因此檢測MRL有十分重要的意義: ①指導臨床治療②預測白血病復發③評價自體骨髓移植的凈化效果。應用FCM檢測MRL的優點在于可在短時間內分析大量標本,具有快速的特點。
    由于白血病細胞缺乏特異性標記,FCM檢測MRL的效果尚不理想,敏感性尚不夠高，一般僅有1/103-104。目前主要有兩類檢測方法: ①用FCM分析CR期骨髓細胞核酸量或染色體,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性僅1-5%。②免疫表型分析,由于尚無白血病特異的標記,只能通過與正常細胞比較某些抗原量的差別及分布部位的不同作為檢測依據;如利用TdT和CD10雙標記檢測MRL,但敏感性亦不高,約0.1-1%。   
假陰性結果可能由于: ①標本中的白血病細胞＜10-4攪或＜10-5;②所取標本不能代表全身骨髓情況; ③病人白血病細胞表型轉換。