流式細胞術在血液學中的應用（六）

白細胞吞噬功能測定

粒、單核-巨噬細胞是機體免疫反應和免疫調節細胞中的重要成員。它們不僅具有吞噬功能,吞噬外來的微生物、腫瘤細胞等,同時又分泌多種生物因子參于免疫反應,此外單核-巨噬細胞對抗原物質的攝取、修飾、遞呈等作用,是淋巴細胞的免疫功能必不可少的。因此檢測白細胞吞噬功能對了解機體免疫狀況有重要意義。以下簡要介紹FCM測定白細胞吞噬功能的概況。

應用光學顯微鏡、熒光顯微鏡測定白細胞吞噬功能時須分離粒、單核細胞, 并盡可能地保持細胞活性。用FCM檢測時不須分離細胞,應用全血即可, 因此可在自然狀態下測定,結果準確可靠。

目標粒子一般以酵母、細菌等能激發自然吞噬作用或予先以抗體調理化的人造粒子為好;并標以熒光,常用者為FITC(異硫氰酸熒光素)或RA(羅達明).

以肝素或拘櫞酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血與目標粒子200μl(目標粒子濃度4×107/ml)置37°C溫育,溫育結束后立即置冰水中, 以同樣標本不在37°C溫育而置于冰水中者作為對照。目標粒子不同溫育時間不一,FITC標記的金黃色葡萄球菌25分鐘,FITC標記的粒子15分鐘即可達到吞噬飽和;此外,粒子與白細胞的比例也很重要,一般為10:1。溫育結束后以溶血劑溶去紅細胞即可上機檢測。
 
應用FCM全血法測定白細胞吞噬功能,對白細胞的丟失、損傷最小;此外用本法可測定血清中的調理素(Opsonine)水平及血清中有無吞噬作用抑制因子。如果用FITC標記的單克隆抗體 CD13、CD14、CD15標記粒、單核細胞,用紅熒光標記目標粒子,即可測定吞噬功能與細胞表面標記的關系,對白細胞吞噬功能作進一步的研究。

NK和LAK細胞活性測定

NK細胞存在于外周血大顆粒淋巴細胞中,它對靶細胞的細胞毒活性不依賴于抗體,無MHC限制性,它們的數量及細胞毒活性是機體免疫系統的重要指標。人NK細胞一般表達CD56、CD16、CD57部分表達CD2、CD8、CD11而不表達CD3。

LAK(Lymphokine Activated Killer cells)細胞主要存在于LGL的高密度群體中,LAK前體細胞表達NK細胞標志CD16而不表達T細胞標志如CD3、CD4、CD5等;它們不需要抗原刺激就能殺傷NK細胞不能殺傷的腫瘤細胞,并且無MHC限制性;從表型上看大多數LAK細胞來自NK細胞,但嚴格講LAK細胞對K562細胞的殺傷活性不能稱作LAK活性,測定LAK活性的靶細胞應為NK抵抗的實體瘤細胞,如HL-60細胞、HeLa細胞等。

常用的測定NK和LAK細胞活性的方法較多,如攩51Cr釋放法、[3H]TdR參入法或釋放法、LDH釋放法、ATP發光法等;應用放射性同位素對人體和環境不利,利用FCM測定NK和LAK細胞活性從1986年就開始摸索,方法已趨于成熟,以下介紹其中一種:

肝素抗凝取外周血后分離PBMC后洗凈,調整細胞濃度為106/ml,為效應細胞;靶細胞分別為K562和HL-60或HeLa細胞,在對數生長期受集細胞,調整濃度為106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)標記靶細胞,效應細胞:靶細胞(E:T)為40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死細胞,洗凈后即可上機檢測。DiO發綠熒光,PI發紅熒光,利用雙參數(FL1vFL2)直方圖可清楚地了解靶細胞中的死亡細胞,計算出靶細胞%溶解率。

造血干/祖細胞測定

造血干/祖細胞移植已廣泛應用于血液腫瘤、實體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等，因此檢測造血干/祖細胞已成為臨床必不可少的手段。應用流式細胞儀多色技術測定外周血造血干/祖細胞，具有快速、準確的優點，不僅能確定造血細胞數量，而且能對造血干祖細胞的質量進行評價，為臨床干細胞移植治療提供重要數據。目前多色組合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。

CD34抗原是一種分子量約11萬的糖蛋白，選擇性地表達于早期造血干/祖細胞、小血管內皮細胞和胚胎纖維母細胞表面。該抗原在原始造血細胞上表達，以后隨細胞分化、成熟逐漸減少直至消失，因此一直作為造血干/祖細胞表面的一種特征性標志而廣泛應用于造血干細胞基礎研究和臨床。CD34+細胞是一群不均一的群體，依其是否表達CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亞群表現出了不同的造血性能。最近隨著造血理論的深入研究關于造血干細胞究竟是否都是CD34+細胞出現一些爭論,實驗研究證明, CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞更具造血潛能,有人經實驗研究提出CD34的表達與造血干細胞的細胞動力學相關,細胞激活時CD34+,細胞處于穩定狀態時CD34-;也有人提出CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發育階段更早。我們認為：成人體內可能仍保留著一小部分原始間充質細胞，他們仍保留著多向分化能力，也能向造血干細胞分化，因此體內有CD34-造血干細胞和CD34+造血干細胞是正常的，CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發育階段更早、更具造血潛能；但目前的用CD34+細胞代表造血干細胞的檢查方法已足以滿足臨床需要，因為臨床實踐已證明這一點。理論研究往往能推動學術發展，開發新技術，我們期待著造血理論的不斷發展給臨床帶來新技術，不斷提高臨床療效。

我們用CD34、CD38、HLA-DR三色組合測定了151份外周血經動員后標本，CD34+細胞占單個核細胞（MNC）的（0.954±0.466）%，含量為（3.55±2.41）×109/L；其中CD34+CD38-亞群含量為（0.253±0.24）×109/L，占CD34+細胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亞群含量為（0.273±0.310）×109/L，占CD34+細胞的7.61%；隨著采集次數的增加，CD34+細胞及其亞群數量逐漸減少（P＜0.05）；隨著供者年齡增加，其外周血CD34+細胞數逐漸減少，在≥40歲供者CD34+細胞百分比和含量比＜20歲供者分別降低了47%和50%；動員后外周血CD34+細胞數存在性別差異，男性供者外周血CD34+細胞數較女性高23%。 

應用流式細胞儀測定造血干細胞雖具有快速、準確的特點，目前被廣泛采用。但應用中要特別重視質量控制，要建立一套完整質控方法以確保檢測的準確性。