流式細胞術檢測樣品推薦制備方法

A. 直接標記抗體（FITC標記抗體）：

(1) 收集1×106個細胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

(2) 用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞，800rpm離心5min。

(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×105個細胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測即可。

(4) 用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。

B. 未標記抗體間接免疫熒光標記法：

（1）收集2×106個細胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次，800rpm離心5min。

（2）用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細胞，800rpm離心5min；

（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。

（4）加入飽和劑量未標記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細胞，800rpm離心5min，洗去未結合一抗，重復一次。

（5）加入熒光標記（FITC）標記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。

（6）加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細胞；固定待測。

（7）流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。

C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：

（1）待測樣本制成單細胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。

（2）用4℃預冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。

（3）調整細胞濃度為106細胞/毫升，取1毫升細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。

（4）PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。