淺析重組蛋白純化中樣品的預處理

樣品預處理也稱為樣品前處理，是指消除干擾因素完全保留被測成份，并使被測成份濃縮，以獲得可靠的分析結果。在重組蛋白純化實驗中，首先要對不同來源的材料進行預處理，樣品預處理的目的主要有除去微粒、減少干擾雜質、濃縮微量組分、提高檢測靈敏度及選擇性、改善分離效果、有利于色譜柱和儀器的保護等。因此樣品處理技術就成為提高分析測定效率、改善和優化色譜分析的重要環節。

自90 年代以來,基因重組技術得到很大的發展，基因工程產品的分離純化的成本約占全部成本的60%～80%，因此重組蛋白純化技術越來越重要。美迪西生物醫藥是一家醫藥研發外包公司，在重組蛋白表達與純化服務方面經驗豐富，其擁有多種蛋白表達系統，包括原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統（桿狀病毒）哺乳動物細胞蛋白表達系統，具備多種融合技術。

1、樣品預處理是重組蛋白純化的重要步驟，常采用的技術有

（1）溶劑提取法

同一溶劑中，不同物質具有不同的溶解度。利用混合物中各物質溶解度的不同將混合物組分完全或部分分離的過程稱為萃取，也稱提取，常采用浸泡法或溶劑萃取法。

（2）鹽析法

向溶液中加入某種無機鹽，使溶質在原溶劑中的溶解度大大降低，而從溶液中沉淀析出，這種方法叫做鹽析。如在蛋白質溶液中加入大量的鹽類(硫酸銨)，特別是加入重金屬鹽，使蛋白質從溶液中沉淀出來。

在進行鹽析工作時，應注意溶液中所加入的物質的選擇，它應是不會破壞溶液中所要析出的物質，否則達不到鹽析提取的目的。

（3）化學分離法

如色層分離法、沉淀分離法、磺化法和皂化法、掩蔽法等。

（4）濃縮法

食品樣品經提取、凈化后，有時凈化液的體積較大，被測組分的濃度太低，會影響最后結果的測定，此時需要對被測樣液進行濃縮，以提高被測成分的濃度。常用的方法有常壓濃縮和減壓濃縮兩種：

2、樣品預處理誘導方式的選擇

在誘導方式的選擇上，為了得到正確折疊的目的蛋白，要考慮表達菌種的生長情況、菌種是否健壯、是否是單克隆菌種、菌體的濃度是否適合誘導等。生長狀態不好的表達菌，一方面會造成目的蛋白的錯誤折疊，造成蛋白大小、形態等發生改變，另一方面會因為誘導劑IPTG的加入，導致菌體的死亡或者降解。

低溫度誘導有助于蛋白二硫鍵的正確折疊，但對于高溫表達的蛋白不適合低溫狀態，溫度過高容易導致包涵體的形成。

3、選擇合適的誘導劑

基因的誘導表達基于乳糖操縱子調節機制，沒有乳糖存在的時候，阻礙物基因產生阻礙蛋白，阻礙蛋白和操縱子結合，抑制基因的表達；當有乳糖存在的時候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用產生異半乳糖，異半乳糖和阻礙蛋白結合，解除抑制、激活基因，開始表達蛋白。誘導的濃度的高低對目的蛋白的表達也會產生影響。

4、抽提方式

進行破壁之前應該選擇合適的緩沖組分，合適的pH 要結合酸堿溶液的滴定調節，盡量低的離子強度，加入一些穩定成分穩定成分，EDTA螯合重金屬離子，表面活性劑，保護非極性表面等。

5.確定蛋白質樣品的形態，濃度、黏度、體積。

有時候得到粗蛋白的時候，會觀察是否符合目的蛋白的一些性質，確保得到是目標蛋白。粗蛋白的形態有沒有明顯的差異，濃度是否符合純化的要求，是否有較多的干擾物質等。

6.優化表達條件

（1）重組蛋白不表達或者表達量低。

如果重組蛋白不表達（包含體和可溶蛋白都沒有）通過改變誘導劑濃度、誘導溫度、時間等都不表達的時候，然后嘗試更換菌株、質粒載體。

降低誘導后培養溫度，重組蛋白表達得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在4℃時依然可以表達重組蛋白，而將培養溫度降低就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導的重組蛋白表達。

減少誘導劑，誘導劑濃度可以降低至1/10；選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。這類菌株能夠使進入每個細胞的誘導劑濃度相同。重組蛋白在所有細胞中的表達水平相當時，減少誘導劑的效果更好。

（2）檢查密碼子構成，使其適應宿主菌的密碼子偏好

稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子，會降低mRNA穩定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子（尤其是N端）突變為宿主偏好的密碼子，能夠顯著提高表達水平，改善蛋白穩定性。

處理高毒性蛋白：毒性極高的重組蛋白，其本底表達就會殺死原核宿主，質粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達，采用可表達T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑，采用含有T7溶菌酶質粒的宿主，如pLysS可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達量，在受到IPTG誘導時也能較好的表達蛋白。

（3）包涵體表達

包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、變復性條件需要長時間摸索等，即使包涵體蛋白成功復性，其均一性和活性依然備受質疑。但是包涵體表達也有其優勢：能夠很輕松的獲得超高的表達量，不可溶的重組蛋白不會被宿主內的蛋白酶降解，重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白含量低容易純化等。

由于這些優點以及蛋白質復性條件的不斷發展，表達包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重組蛋白表達的一個常用方案。