液態活檢技術發展趨勢

　　 液態活檢技術自問世以來便發展十分迅速，針對CTC、ctDNA和外泌體的分離、捕獲、富集、純化已經開發出諸如免疫法、磁分選法、膜過濾法、ddPCR法、差速離心法等，而關于其鑒定、分析也涌現了許多前沿技術，正是這些技術的不斷涌現推動了液態活檢一步步進入臨床實踐。雖然液態活檢技術已經取得了長足進展，但科研工作者對于其持續的優化卻一點也沒有停止，從目前對液態活檢技術研發的趨勢來看，人們越來越傾向于研發自動化、微型化和高通量化的儀器，因為傳統的手工操作方法存在步驟繁多、耗時長久、人為誤差較大等問題，既不利于臨床樣本的大批量檢測也難以確立穩定的富集效率和鑒別標準。所以，在現有技術的基礎上充分地聯合其他檢測方法，在不增加整個檢測過程的復雜程度的同時實現多模式的綜合檢測，以完成高效、準確、廉價的檢測應是未來的開發研究重點。

　　目前關于CTC的檢測已經出現了微流控技術、納米技術和單細胞測序技術，這些技術的出現在一定程度上加速了CTC檢測的自動化進程。尤其以微流控和納米技術為代表，其精準的控制性能、高效的檢測效率和簡單便捷的操作優勢已經助力其在生物醫學領域大放光彩。目前很多自動化的檢測平臺均采用了該技術，下面分別介紹其各自的特性以及發展現狀。

　　通常微流控指的是使用微管道？處理微小流體的系統所涉及的科學和技術，是一門涉及化學、流體物理、微電子、新材料、生物學和生物醫學工程的新興交叉學科。由于其具有微型化、集成化等特征，故微流控裝置通常又被稱為微流控芯片。微流控被認為在生物醫學研究中具有巨大的發展潛力和廣泛的應用前景。目前的CTC芯片分選原理可以大概歸納為被動分選與主動分選兩大類。不同種類的細胞在尺寸、密度、形狀、可變形性及親和性等物理、生物特性上各不相同，依據這些不同的特性，被動分選技術通過流道內的微結構或微流體對細胞施加作用，從而實現分離，一般具有通量高、不需要額外施加作用力場的優點。這些分離方法主要包括微結構過濾、場流及水力分選、確定性側向偏移、慣性分選、仿生分選及親和性分選等幾類。主動分選技術通過外力場對樣品流中的細胞施加作用力，從而致使其分離，其分選精度往往高于被動分選技術。這些分選方法主要包括介電泳分選、磁分選、聲分選、光分選等幾類。鑒于目前微流控技術還存在分選純度不高、通量偏低等問題，尤其是面向外周血中含量極低的CTCs 的分選，難以同時滿足高通量、高純度的分選要求。因此，研究人員多采取將被動分選技術和主動分選技術相結合的多級分選芯片以達到對稀有細胞的分選要求。

　　被稱為第二代CTC捕獲技術的微流控CTC芯片技術（CTC-Chip）展示出了其用于分離檢測CTC的極大潛力。CTC芯片是一張與標準載玻片尺寸相同的硅片作為固相支持物，上面排列了多個蝕刻特殊排列微單元。該方法非常靈活，可以與不同的CTC分選策略相結合，如各種不同的抗體都可以包被在固相支持物上，大大提高了敏感性和從全血中捕獲稀少細胞的得率，同時操作過程相對簡單溫和，從而使分離到的CTC保持一定的活力。雖然目前的微流控CTC芯片在設計、加工工藝上更復雜些，但其良好的分選效果、輕巧的體積、較少的進樣體積、較高的靈敏度和即用即棄的便捷特性正吸引越來越多的目光，是未來產業化發展的一個主要方向。

　　但是微流控芯片技術應用于稀有細胞分選仍然存在一定的不足，比如目前已經研究發現CTC存在16種亞型，為達到較高的捕獲效率需要固定對應的抗體，而有些抗體尚未實現商品化或者CTC不表達相應的抗原就會造成漏檢；現階段微流控平臺仍依賴于特異性的免疫識別，還無法做到對CTC全亞型和CTM以及被白細胞包裹的CTC的捕獲，從外周血液中獲取極少的CTC仍存在較大的困難，并且需要耗費一定的時長以保障其能發生較為充分的免疫反應，即便是基于抗原抗體吸附的方法仍不能完全避免CTC丟失的情況；而且微通道中微結構的擠壓，高剪切流的流場，外加的電場都會對細胞的活性造成一定程度的損傷，對后續的分離培養造成困擾。

　　近年來納米技術的飛速發展，已被成功應用到許多領域，包括醫學、藥學、化學等。納米顆粒具有獨特的光學、電學、化學、機械和物理性質，這在解決醫學檢測方面的難題上起到了巨大的促進作用。納米材料根據材質和形狀不同可分為很多種，如金納米顆粒、磁納米顆粒、碳納米管、納米孔和微懸臂等。隨著納米技術的發展，人們可獲得結構可控、表面功能化的不同種納米材料，納米材料所表現出的小尺寸效應、高比表面積等諸多不同于一般材料的特性，使血液中極少量的CTC 的捕獲成為可能。納米材料與納米結構與CTC的高接觸幾率，也可以大大提高CTC的富集效率被廣泛用于CTC的富集和檢測。納奧生物基于第三代非抗體依賴的捕獲技術開發的Nextctc循環腫瘤活細胞捕獲儀即是結合了國際領先的納米技術和微流控技術，率先在國內實現了非抗體依賴的CTC活性單細胞無損捕獲，利用納米技術捕獲分離的CTC細胞保存了原始的活力，完全可以用于后續的藥敏試驗和全基因型測序，而且還可以最大限度地捕獲上皮來源、間質來源以及干細胞來源所有表型循環腫瘤細胞，最大程度地降低了因為發生EMT過程或形成CTM以及被其他細胞包裹所造成的漏檢。鑒于納米材料的諸多優點，將納米顆粒應用到CTC的檢測中具有非常巨大的潛力。

　　單細胞全基因測序技術及單細胞基因組學的發展，某種程度上解決血液CTCs數量稀少的難題，不需要獲得大量的CTC即可進行基因組學的分析，能檢測更多藥效相關基因及分析耐藥機制，為CTCs的分子分型及靶向藥物治療提供更準確的信息。基因或基因組變異是腫瘤發生的根本原因，利用單細胞全基因組測序技術，可以更精準地獲取腫瘤細胞并深入分析，發現正常細胞與腫瘤細胞差異，了解癌細胞的基因突變，鑒別腫瘤的來源、分析腫瘤生長規律，為早期診斷腫瘤和開展腫瘤個體化治療提供指導。此外，腫瘤的異質性是導致腫瘤耐藥的原因之一。從單個腫瘤細胞水平對腫瘤單細胞進行測序，找出一個腫瘤在單個細胞上的共同結構，揭露每個腫瘤細胞的突變規律，為抗癌藥物研究、腫瘤靶向治療提供基礎。

　　目前，尚存在循環腫瘤細胞數量稀少，與正常細胞的整體差異不是很明顯，且不同部位的腫瘤及不同病人的同部位腫瘤的性質也可能有所不同；早期癌癥患者體內的ctDNA難以富集足夠濃度，早期難以檢測發現；外泌體雖然性能穩定，但目前研究還不充分等問題，這都增加了檢測的難度，也是未來需要解決的問題。但是隨著檢測手段的不斷進步，檢測靈敏度和穩定性的逐步提高，技術瓶頸終會被突破，在可期的將來隨著技術的成熟，液態活檢各種方法聯合使用將在腫瘤早期篩查、動態監測、預后判斷以及產前診斷等領域發揮越來越重要的作用，因為單一的檢測方法已經不能滿足臨床的需要，而越來越傾向于CTC、ctDNA和外泌體聯合輔助診斷，只有液態活檢的“三駕馬車”攜手并進才能更好地推動液態活檢真正走入臨床治療實踐，成為輔助診斷密不可分的一部分。