淀粉酶的固態發酵實驗

實驗方法原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解a-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。在堿性條件下，還原糖與3,5-二硝基水楊酸共熱，3,5-二硝基水楊酸被還原為3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色物質），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色深淺的程度呈一定的比例關系，可在722型分光光度計540 nm波長測定棕紅色物質的吸光度值。查標準曲線計算，可求出發酵液中還原糖的含量，從而求出淀粉酶活力。

實驗材料 麩皮面粉

試劑、試劑盒 NaNO3 KH2PO4(NH4)2SO4CaCl2MgSO4·7H2OCoCl2FeSO4·7H2OZnSO4

儀器、耗材 分光光度計恒溫水浴鍋生化培養箱磁力攪拌器三角瓶

實驗步驟

一、實驗主要儀器設備和材料

分光光度計、恒溫水浴鍋、生化培養箱、磁力攪拌器、三角瓶、麩皮、面粉、NaNO3 、KH2PO4、(NH4)2SO4、CaCl2、MgSO4.7H2O、CoCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4。

二、實驗方法、操作步驟

1.  還原糖的測定

（1）標準曲線的制作

取9支干燥試管編號，按表1所示的量，精確濃度為1.00 mg/ml的葡萄糖標準液和3,5-二硝基水楊酸試劑。表中單位為ml。  

將各管搖勻，蓋上小漏斗，在沸水浴中加熱5 min，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，混勻。切勿用力振搖，以免引入氣泡。在540 nm波長下，以0號管為空白，在分光光度計上測定1-8號管的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖毫克數為橫坐標，繪制標準曲線。 

（2）發酵液中殘留還原糖的測定

發酵液單層濾紙過濾，濾液0.2 ml定容至100 ml，500倍稀釋至含糖量2-8 mg/100 ml為試樣。

取4支干燥試管,編號，按表2所示的量，精確加入待測液和試劑(ml)

試劑加入后，其余操作步驟與制作葡萄糖標準曲線時的相同，測定出各管溶液的吸光度值。

計算

以管1、2、3的吸光度值的平均值在標準曲線上查出相應的還原糖毫克數，按下式計算樣品中還原糖的百分含量： 

2.  氨基態氮的測定

（1）取發酵濾液5.00 ml，置于100 ml燒杯中，加入15 ml水，磁力攪拌器攪拌5 min后，將電位計插入燒杯中，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH=8.20，此為游離酸度，不予計量。加入10.0 ml甲醛溶液，立即混勻，迅速用0.1 mol/L NaOH標準溶

液滴定至酸度計指示pH=9.20，計下消耗NaOH標準溶液的毫升數。同時用水做空白實驗。

（2）計算

氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014×20/5×100

式中： V--加甲醛后試液消耗氫氧化鈉體積，ml;

V0--加甲醛后空白液消耗氫氧化鈉體積，ml;

M-- NaOH標準溶液的濃度,mol/L；

0.014--與1.00 ml NaOH標準溶液相當的氮的質量，g；

（3）淀粉酶活力的測定及計算

淀粉酶活力（IU/g干培養基）：本實驗條件下，每分鐘釋放出1umol還原糖所需要的酶量稱為一個酶活力單位。

（4）總體實驗操作流程：

①配制培養基，滅菌，冷卻。

②冷卻后接種，并攪拌均勻，置于28 ℃培養箱進行培養。

③每隔24 h取樣，用0.2 M 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液（pH6.0）按一定的浸提比進行浸提1 h，離心得粗酶液。共取樣6次。

④分別測定酶液中淀粉酶活力、還原糖和蛋白質含量。

三、實驗結果

1.  以還原糖濃度為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪出不同時間還原糖的變化曲線。

2.  以氨基態氮濃度為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪出不同時間氨基態氮的變化曲線。

3.  以淀粉酶活力為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪出不同時間淀粉酶活力的變化曲線。