深圳先進院首創CRISPR等溫擴增基因檢測技術

　　近日，中國科學院深圳先進技術研究院博士周文華等在CRISPR等溫擴增基因檢測技術領域取得新進展。相關工作“A CRISPR-Cas9-triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive DNA detection”（《一種應用于核酸超敏檢測的CRISPR-Cas9鏈取代擴增技術》）發表于國際刊物《自然-通訊》（Nat. Commun. 2018, 9, 5012）。論文共同第一作者是周文華和研究助理胡麗，通訊作者是研究員喻學鋒。

　　核酸分子檢測已被廣泛應用于精準醫療、食品安全檢疫、公共安全監控等多個領域。盡管基于PCR（聚合酶鏈式反應）的核酸檢測技術被廣泛用于專業檢測機構，但由于該技術操作復雜、儀器昂貴、以及涉及多重變溫過程，并不適用于基層檢測和家庭檢測。為了克服PCR技術的缺點，一類不依賴變溫的檢測技術，即等溫擴增檢測技術得到廣泛關注。然而，當前等溫擴增技術在靈敏度、特異性和抗干擾度方面仍各自有著其內在缺陷，且成熟的等溫擴增技術核心ZL大多掌握在國外公司手中。因此，迫切需要開發出一種性能更優異，且具有完全自主知識產權的新的核酸等溫擴增檢測技術，以滿足我國在核酸檢測領域日益增長的需求。CRISPR/Cas9作為一種源自原核生物獲得性免疫系統的基因定點編輯技術，自發現以來已吸引了大量科研關注和投資興趣。然而，由于人體的復雜性和倫理方面的爭議，基于CRISPR技術的臨床基因治療仍面臨著諸多困難和挑戰。另一方面，由于該技術操作簡便、靈敏度高、抗干擾性強等優勢，目前已開始在體外核酸分子的檢測領域得到應用。但目前以CRISPR技術為基礎的核酸檢測手段仍依賴傳統的PCR技術或等溫擴增技術對靶分子進行擴增，其創新性和適用范圍仍有待提高。

　　針對這些現狀，喻學鋒課題組創新性地提出利用CRISPR系統效應蛋白Cas9在與靶核酸分子結合過程中獨特的構象變化，作為鏈取代等溫擴增反應的開關，高效啟動針對靶核酸分子的指數倍擴增（簡稱CRISDA技術）。相比于傳統PCR和其他等溫擴增技術，CRISDA技術有著諸多獨特優勢。第一，該技術靈敏度高。基于CRISPR技術良好的抗干擾性，該技術可在復雜背景條件下，對aM（10-18M）濃度的靶核酸分子進行高效擴增檢測。第二，CRISDA技術特異性強。通過在機理上的特殊優化，該技術很好地規避了在傳統CRISPR基因編輯技術中普遍存在的脫靶效應，可實現對極低濃度的靶核酸分子進行單核苷酸多態性（SNP）檢測。第三，CRISDA技術普適性極強。在針對不同靶位點的檢測反應中，所需的擴增引物設計簡單、無需優化，可迅速實現對新位點的檢測反應體系開發。除此之外，該技術檢測過程完全等溫，并且在從室溫到42oC的范圍內均保持良好的擴增檢測效果，可充分滿足在實際檢測中對新靶點的檢測需求。目前，課題組已利用該技術成功檢測出人基因組中乳腺癌相關的單核苷酸位點突變，并在野生型大豆中成功檢測出萬分之三的轉基因大豆。

　　同時，由于CRISDA技術所具有的獨特優勢和超越傳統PCR技術的應用前景，以該技術為背景的“基于CRISPR-Cas系統的核酸高敏快速等溫檢測技術”項目在中科院首屆“率先杯”未來技術創新大賽中，從數百個項目中脫穎而出，獲得最終優勝獎，并已吸引了多家投資機構前來洽談產業化事宜。目前，課題組正將該技術應用于突發或新型傳染病的檢測，如新型流感、非洲豬瘟等，并正積極開發相關檢測試劑盒。

　　該研究工作得到國家自然科學基金、深圳市科技計劃國際合作研究、中科院前沿科學研究重點計劃、深圳科技研究計劃、英國利華休姆信托基金和香港研究資助局面上項目等的資助。

圖1: 傳統PCR技術與CRISDA檢測技術對比。

圖2: 利用CRISDA技術對aM量級的靶分子進行特異性擴增檢測。（a）擴增體系設計；和（b）利用CRISDA技術對合成的DNA片段進行特異性擴增檢測。（c）利用CRISDA技術對來自人基因組的DNA片段進行特異性擴增檢測。（d）利用CRISDA技術對人基因組的特定區域進行特異性擴增檢測。

圖3: 利用CRISDA技術對aM量級的靶分子進行SNP擴增檢測。（a）不同細胞株基因組中rs3803662位點的測序驗證；（b）利用CRISDA技術對該SNP位點進行高靈敏度擴增檢測。