深圳大學Nature子刊CRISPR研究成果

　　最近，有研究報道CRISPR-Cas9系統能夠靶定病毒RNA，因此這種現象提出了一個有趣的問題：Cas9是否也可能影響細胞mRNAs的翻譯。7月13日，來自深圳大學第一附屬醫院的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》上發表題為“Targeting cellular mRNAs translation by CRISPR-Cas9”的研究成果，對這個問題進行了探討。

　　這項研究的通訊作者是深圳大學第一附屬醫院中心實驗室副研究員黃衛人，其2009年畢業于中山大學，北京大學博士后，主要從事泌尿生殖系統疾病發生機制、腫瘤免疫細胞治療，合成生物學腫瘤治療、個體化診斷及治療研究。承擔國家重點基礎研究計劃（973）、國家高新技術發展計劃（863）、國家自然科學基金、中國博士后基金、廣東省自然科學基金、深圳市科技計劃項目等多個項目，以第一作者或者通訊作者在Nature Communications等雜志發表SCI論文10多篇，申報國家發明ZL8項。

　　細菌II型CRISPR-Cas9系統是基礎生物學和生物工程中一種新興的多功能工具。Cas9內切酶可以通過一條向導性RNA（sgRNA），靶定和切割含有PAM的雙鏈DNA。DNA打靶的特異性是由sgRNA-DNA堿基配對和PAM序列決定的。CRISPR-Cas9通常被重新編程為介導原核和真核系統中的基因組修飾，在工業、農業和醫學上具有很好的應用。核酸酶缺陷的Cas9與轉錄激活因子或抑制因子融合，能在基因組范圍內激活或抑制靶基因的轉錄。當呈現PAM的寡核苷酸作為單條DNA出現時，Cas9也可以切割單鏈DNA / RNA靶標。盡管在基因組編輯和基因調控領域引起了廣泛的興趣，但是這項技術還是受到脫靶效應這些問題的限制。目前，根據深度測序的結果，研究人正在開發減少這些影響的具體策略。

　　與CRISPR-Cas9誘導的 DNA干擾相反，傳統的技術——包括反義RNA、核酶和RNA干擾，會在mRNA水平影響基因的表達。反義RNA通過Watson-Crick堿基配對，直接抑制互補mRNA的翻譯。在設計一種重編程核酶的時候，一段引導序列被用來與靶mRNA雜交，并引導核酶的特異性裂解。小干擾RNA，如siRNA、shRNA，可通過指導RNA誘導的沉默復合物（RISC）結合并降解mRNA，而介導基因沉默。基于這些觀察結果——mRNA靶標可結合一段與mRNA互補的單獨序列，sgRNA也有一段反義序列，科學家們想知道，sgRNA-Cas9復合物是否影響mRNA的穩定性和翻譯。雖然其他CRISPR-Cas系統的sgRNA能靶定RNA，但是Cas9被認為不能切割沒有單獨PAM呈現寡核苷酸存在的RNA。

　　直到最近，有研究報道，sgRNA-Cas9復合物可以不依賴于PAM而與丙型肝炎病毒（HCV）的RNA結合，并抑制病毒蛋白的生產。雖然真核核糖體可以翻譯細胞的mRNA和病毒RNA，但其翻譯起始的機制是完全不同的。HCV RNA的翻譯是由內部核糖體進入位點（IRES）介導的，而細胞mRNA的翻譯是由含有多個起始因子的5′-帽結構觸發的。因此，目前還不清楚的是，當不存在攜帶PAM的DNA時，sgRNA-Cas9復合物是否影響細胞基因的mRNA翻譯。

　　在這項研究中，研究人員表明，自然和催化失活的Cas9可以抑制細胞基因的mRNA翻譯，sgRNA 5’端的第一個14nt，對于這個過程是必不可少的。CRISPR-Cas9可以抑制一個意想不到的靶基因的蛋白表達，而不影響其DNA序列，也不會造成意想不到的表型變化。利用設計的RNA適配子-配體復合物——它會阻礙翻譯機器，研究人員表明，障礙機制是引起這一現象的原因。這項研究表明，Cas9研究應該通過在DNA和蛋白質水平上檢測基因的變化，而避免潛在的脫靶效應。