煮沸裂解法制備質粒DNA實驗

抗生素 乙醇 異丙醇 乙酸鈉 STET TE 溶菌酶

LB、YT 或 Terrific 培養液 沸水浴

一、材料

1. 緩沖液及溶液

(1) 用于質粒篩選的抗生素

(2) 乙醇

(3) 異丙醇

(4) 乙酸鈉（3.0 mol/L，pH 5.2）

(5) STET

(6) TE（pH 8.0），含 20 μg/ml 的 RNase A

2. 酶和緩沖液

(1) 溶菌酶（10 mg/ml）

3. 培養基

(1) LB、YT 或 Terrific 培養液

4. 專用設備

(1) 沸水浴

二、方法

1. 細胞的制備

(1) 挑取轉化細菌的單菌落，接種到 2 ml 含適當抗生素的培養液（LB、YT 或 Terrific 培養液）中，于 37℃ 劇烈振搖，培養過夜。

為了確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管不宜蓋緊；培養物應在劇烈振搖下培養。

(2) 將 1.5 ml 培養液倒入微量離心管中，于 4℃ 下以最大速度離心 30 s。將未離心的培養液在 4℃ 儲存。

(3) 離心結束，盡可能吸干培養液。

除去上清的簡便方法是用一次性吸頭或巴斯德吸管與一個真空管道和一個側臂燒瓶相連。輕微抽吸，并使吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，以盡量避免沉淀被吸到側臂燒瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培養液，并用吸頭除去管壁上附著的液滴。



未從細苗沉淀中除去所有培養液的后果是質粒不能被限制酶切割或不能完全切割。這是因為培養液中的細胞壁成分抑制多種內切酶的活性。

(4) 用 350 μl STET 重懸細菌沉淀。

確保細菌迅速完全地重懸于 STET。將兩個離心管的底部接觸同時振蕩，重懸效果更好。

2. 細胞的裂解

(1) 加 25 μl 新配制的溶菌酶溶液。蓋上離心管蓋，輕微渦旋混合 3 s。

(2) 將離心管于沸水浴中精確放置 40 s。

延長超螺旋 DNA 暴露于堿的時間會使其不可逆變性（Vinograd and Lebowitz 1996），所產生的環狀卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋 DNA 的兩倍，難以被溴化乙錠染色。從細菌中用堿裂解法提質粒時可能會看到微量的這種 DNA。

(3) 在室溫下用微量離心機以最大速度離心細菌裂解液 15 min。將上清倒入潔凈離心管中。

3. 質粒 DNA 的回收

(1) 在上清中加入 40 μl 2.5 mol/L 的乙酸鈉（pH 5.2）和 420 μl 異丙醇以沉淀核酸。振蕩混勻溶液，并在室溫下放置 5 min。

(2) 在 4℃ 用微量離心機以最大速度離心 10 min，回收沉淀的核酸。

在離心機中放置離心管時，最好養成總是用同一種方式放置的習慣。例如，按一定順序將離心管的塑料柄朝外，這樣沉淀總是聚集在離轉頭中心最遠的離心管內壁。知道 DNA 沉淀在什么地方，可以較容易地找到可見的沉淀，也就能有效地溶解看不見的沉淀。

當從大腸桿菌的 endA⁺ 菌株中提取質粒時，應該用苯酚：氯仿抽提，簡單步驟如下：用 100 μl TE （pH 8.0）重懸異丙醇沉淀下來的 DNA；加入 100 μl 苯酚：氯仿（1:1，V/V），渦旋混勻 15~30 s；室溫下以最大速度離心 2 min，分離水相和有機相；將水相轉移到新離心管中，加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2）和 2.5 倍體積乙醇，以最大速度離心 10 min 回收核酸，后續處理接下面。

(3) 按步驟 3 所述除去上清，在紙巾上倒置離心管使所有液體流盡。用 Kimwipe 或一次性吸頭除去黏附在管壁上的液滴。

通常在離心管底部的管壁可以看到乳狀核酸沉淀。

(4) 于 4℃ 用 1 ml 70% 乙醇漂洗核酸沉淀，再按步驟 3 中的方法除去所有上清。

這一步要特別小心，因為有時候沉淀并不緊貼管壁。

(5) 除去管壁上所有的乙醇液滴。敞開管口放置在室溫下，直到乙醇全部揮發，管壁上看不到液滴（2~5 min）為止。

如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情況下它會變得難以溶解并且可能變性（Svaren et al. 1987）。將沉淀在室溫下干燥 10~15 min 對于乙醇揮發來說足夠了，而且不會引起 DNA 脫水。

(6) 用 50 μl 含 RNase A（胰 RNA 酶，無 DNase ) 的 TE ( pH 8.0）溶解核酸，輕輕地渦旋混勻，置 -20℃ 保存。