環狀RNA（circRNA）功能研究又一利器——過表達載體

circRNAs

環狀 RNA（circular RNAs,circRNA）是一類具有閉合環狀結構的 RNA 分子，早在 20 世紀八十年代即有研究報道，但由于其表達豐度低，文獻報道較少，一直被認為是 RNA 轉錄剪切的罕見錯誤而被忽視。

直到 2012 年開始有研究者開始大批量鑒定 circRNAs，從古生菌、線蟲、小鼠和人類細胞鑒定出大量 circRNAs，揭示 circRNA 大量存在于真核轉錄組中，是細胞基因表達的一個普遍現象，并可能發揮重要的生物學作用。進一步研究表明 circRNAs 在不同物種中高度保守，多數 circRNAs 表達水平與對應的線性 RNA 相當，部分 circRNAs 表達水平可超過線性 RNA 表達量的 10 倍，且其表達具有一定的組織、時序特異性。circRNAs 具有閉合環狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線性 RNA 更穩定。

已有研究表明 circRNAs 在中腦發育、帕金森、阿爾茲海默病和腫瘤發生中發揮重要作用。近幾年研究證實或推測 circRNAs 的功能主要有：

（1）充當 ceRNA 或 miRNA 海綿（miRNA sponge），通過 MRE(microRNA response element, MRE) 競爭性結合 miRNA 調節基因的表達。例如 ciRS-7/CDR1as 和 Sry 可以結合 miRNAs 而不被降解，可能是潛在的 ceRNA 分子。

（2）通過堿基互補配對直接調控其他 RNA 表達。例如 CDR1as 能與 CDR1 mRNA 互補配對, 從而增強 CDR1 mRNA 的穩定性；（

3）與蛋白質結合，例如 CDR1as 能與 AGO 蛋白 (Argonaute) 緊密結合。

（4）作為翻譯的模板指導蛋白質的合成。

（5）與聚合酶 II（RNA polymerase II，Pol II）相互作用以順式作用調控宿主轉錄活性。例如 circEIF3J 和 circPAIP2 通過與 U1 snRNP 和 PolⅡ形成復合體，結合到其宿主基因的啟動子區域調控其表達。

circRNAs 由于其特有的結構和復雜的功能機制，對其研究起步較晚，但已證實其具有重要的調控作用并在疾病發生中發揮重要作用，成為 RNA 和轉錄組研究的熱點。對 circRNAs 的功能和機制研究工具也趨于成熟，circBase 數據庫中已收錄人的 circRNAs 9 萬多個，同時收錄小鼠和線蟲等物種的 circRNAs。Circular RNA Interactome 數據庫可用來預測 circRNAs 與 miRNAs 和 RBPs 的結合位點。計算機軟件 find_circ(Memczak et al,2013)、CIRCexplorer(Zhang et al,2014) 和 CIRI(Gao et al,2015) 都被用來預測鑒定 circRNAs。多家公司也已推出芯片或測序方案（CircRNA-Seq）用來發現 circRNAs。

對于 circRNAs 的功能性過表達（Gain of function）研究，研究者多基于 circRNAs 的側翼序列特征，PCR 分段擴增目標 circRNAs 的側翼 Alu 序列或內含子互補序列上下游各 200-1000bp 序列和目標 circRNAs 序列，構建 CMV 啟動子的表達載體。其分段擴增步驟復雜，構建周期長，且過表達倍數有限。

吉賽生物利用ZL技術，成功研發出特異性準確過表達 circRNAs 的表達載體，率先為研究者提供簡便高效的 circRNAs 過表達研究策略。現已推出 pCD-ciR、pLO-ciR 和 PLCDH-ciR 三種 circRNAs 表達載體，適用于普通真核表達，慢病毒包裝，綠色熒光和嘌呤霉素篩選等多種用途。該載體含有吉賽生物ZL技術的 circRNAs 環化表達框架，載體轉染細胞后可通過 RNA 剪切形成 circRNAs 分子。

研究者僅需以 PCR 擴增目標 circRNAs 的線性序列，克隆進表達載體中即可，大大簡化實驗步驟，節約時間。

應用 circRNAs 表達載體構建 100 多個目標 circRNAs 的過表達載體，并在 HEK293、SH-SY5Y、Hela、Ej、T24、HepG2 和 MHCC-97 H 等多種細胞系中完成驗證

吉賽生物 circRNAs 表達載體有如下特征：

1）過表達效率高。circRNAs 表達載體上加有吉賽生物ZL技術的上下游環化框架，驗證過的所有 circRNAs 都能顯著過表達 50 倍以上，最高可過表達 800 倍。

2）序列環化準確。環化框架內部引入吉賽生物ZL技術的環化介導序列，有效保證目標 circRNAs 的線性序列準備環化，驗證過的所有 circRNAs 都能準確環化，無堿基添加或缺失。

3）過表達穩定性高。驗證過的目標 circRNAs 從 200bp 到 2500bp 序列都能實現準確高效過表達。

4）適用范圍廣。pCD-ciR 可轉染細胞瞬時表達，pLO-ciR 和 PLCDH-ciR 可轉染細胞瞬時表達，也可包裝慢病毒構建穩定細胞系，PLCDH-ciR 可同時表達 GFP 熒光和 Puromycin 抗性基因，可以方便地進行篩選。