瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗原理和操作方法

實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定DNA片斷的典型方法，其特點為簡便、快速。DNA片斷瓊脂糖凝膠電泳的原理與蛋白質的電泳原理基本相同，DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過介質而泳動，除電荷效應外，凝膠介質還有分子篩效應，與分子大小及構想有關。對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數值成反比。在凝膠中加入少量溴化乙錠（有毒！），其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種光絡合物，在254~365nm波長紫外光照射下，呈現桔紅色的熒光，因此可對分離的DNA進行檢測。電泳時以溴酚藍及二甲苯氰（藍）作為雙色電泳指示劑。其目的有：①增大樣品密度，確保DNA均勻進入樣品孔內；②使樣品呈現顏色，了解樣品泳動情況，使操作更為便利；③以0.5×TBE做電泳液時溴酚藍的泳動率約與長300bp的雙鏈DNA相同，二甲苯氰（藍）則與4bp的DNA相同。

線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關系

試劑和器材

一、試劑
5ⅹTBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa2溶于去離子水中，定容至1L。電泳時10倍稀釋使用。
5ⅹ上樣緩沖液：用5×TBE溶液配制0.5%溴酚藍，再加等體積甘油混勻。
溴化乙錠溶液：5mg/ml的溴化乙錠，避光保存。
0.7%瓊脂糖，用1×TBE溶液配制。
二、器材
電泳儀、水平電泳槽、紫外分析儀。

操 作方法
（1）瓊脂糖溶液的制備：配0.7%瓊脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；將溶液冷卻到約50~60℃，加入溴化乙錠到終濃度為0.5ug/ml。
（2）將瓊脂糖溶液倒入電泳支架上，放上梳子，梳子須離開電泳支架底部1mm左右。待凝膠凝聚后，小心拔去梳子，將支架放入裝有電極緩沖液的電泳槽中，電極緩沖液應淹沒過膠。
（3）電泳
取薄膜，滴加上樣緩沖液和DNA樣品5~10ul，混勻，用微量移液器加入樣品槽中。點樣端朝負極，通電。電壓為10v/cm。至溴酚藍移到距邊1cm處，取出凝膠，紫外燈下檢測。
注意：
溴乙啶是一種強致突變劑，在操作和配制試劑時應戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應進行如下處理：
方法I：（1）每100ml溶液中加非離子型多聚吸附劑Amberlite XAD-16.29g；
（2）室溫下放置12小時，不時搖動；
（3）用新華1號濾紙過濾，棄濾液；
（4）用塑料袋封裝濾紙和Amberlite樹脂，作為有害廢物丟棄。
方法Ⅱ：（1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭；
（2）室溫條件下放置1小時，不時搖動；
（3）用新華1號濾紙過濾，棄濾液；
（4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物丟棄。
溴乙啶在260℃分解，在標準條件下進行焚化后不會有危險性；Amberlite XAD–16或活性炭可用于凈化被EB污染的物體表面。