瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中DNA的回收（電洗脫至透析袋）

限制性內切核酸酶DNA 樣品

乙醇EB 或 SYBR Gold 染色液酚氯仿乙酸鈉TBE 電泳緩沖液

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠煮過的透析袋透析袋夾水平電泳槽手提式長波紫外燈

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇

EB 或 SYBR Gold 染色液

酚：氯仿（1:1 , V/V)

乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)

0.25X TBE 電泳緩沖液

含 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 0.25 X TBE 電泳緩沖液

2. 酶和緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 樣品

5. 專用設備

煮過的透析袋

透析袋夾

水平電泳槽

手提式長波紫外燈（302 nm）

二、方法

1. 消化可以獲得至少 100 ng 的目的 DNA 片段。在適當濃度的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺中進行電泳分離，用含有 0.5 μg/ml 溴化乙錠或 SYBR Gold 染色。用手提式長波長紫外燈確定所需條帶的位置。

2. 用一鋒利的手術刀片或剃刀片，切下含有目的條帶的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠切片，置于用 0.25X TBE 濕潤的方形石蠟膜上。盡可能使切下的瓊脂糖體積最小，以減少抑制劑對 DNA 的污染，并縮短 DNA 遷移出凝膠的距離，同時也保證能容易地將其放入透析袋中。

3. 切下條帶后，進行照相，以獲得洗脫條帶的記錄。

4. 戴上手套，用透析袋夾將透析袋一端封住。用 0.25X TBE 充滿透析袋直至激出，拿住袋頸，輕擠透析袋以打開袋口。用藥勺將凝膠切片轉移至充滿緩沖液的透析袋中。

5. 使凝膠切片沉至袋底。去掉大部分緩沖液，留下足夠液體以使凝膠切片始終保持與緩沖液接觸。然后就在凝膠切片上方用透析袋夾將袋夾緊，避免存留氣泡和夾碎凝膠切片。在透析袋夾上用記號筆標記上 DNA 片段的名字。

6. 把透析袋浸泡在盛有一淺層 0.25X TBE 的水平電泳槽中。用玻璃棒或吸管防止透析袋漂浮，同時使凝膠切片的方向與電極平行。使電流通過透析袋，電壓通常為 7.5 V/cm, 持續 45~60 min。用手提式長波紫外燈來監測 DNA 從凝膠切片中遷移出來。

如果電泳時間太短，只有部分的 DNA 從凝膠切片中遷移出來，這樣會降低回收率。同樣，如果電泳時間太長，則會導致 DNA 附著到透析袋壁上。通常在 0.25X TBE 緩沖液中，電壓為 7.5 V/cm, 持續 45~60 min 就可以從凝膠切片將 0.1~2.0 kb 的 DNA 片段洗脫約 85%。



7. 倒轉電流的極性電泳 20 s，使 DNA 從管壁上釋放下來。切斷電源，從電泳槽中取出透析袋，輕揉它以便使 DNA 進入緩沖液。

8. 反向電泳后，打開透析袋夾，小心將凝膠周圍的所有緩沖液轉移至一個塑料管中。從袋內取出凝膠切片，如步驟 9 介紹的將其染色。用巴斯德吸管吸取少量 0.25X TBE 沖洗透析袋，將洗液加到塑料管中。

9. 將凝膠切片浸入含有溴化乙錠（0.5 μg/ml) 的 0.25X TBE 中，于室溫染色 30~45 min。在紫外線下檢査凝膠切片，確證全部 DNA 已被洗脫。

10. 通過 DEAE-SepHacel，或用市售樹脂層析，或用酚：氯仿抽提和標準的乙醇沉淀純化 DNA 片段。