破冰行動：提速DNA電泳速度

來自賓夕法尼亞州費城杰佛遜醫學院(Jefferson Medical College）外科系，以及Kimmel腫瘤中心（Kimmel Cancer Center）的研究人員申請到了一項新ZL，這項ZL也許未來某天會成為DNA分析過程中的關鍵技術，而且這一發現也可以應用于多個領域，比如法醫鑒定，克隆或者生物恐怖（bioterrorism）。

這一ZL由約翰霍普金斯醫學院助理教授Jonathan Brody博士，以及其同事Scott Kern共同擁有，他們發明了一種新的技術，能將DNA分離技術，即DNA電泳的速度提高5倍，并降低實驗成本。Brody博士表示，“僅僅通過提高分析的速度，它就能幫助我們每年節省數百萬美元。”

凝膠電泳是一大類技術，被科學工作者用于分離不同物理性質（如大小、形狀、等電點等）的分子。凝膠電泳通常用于分析用途，但也可以作為制備技術，在采用某些方法（如質譜(MS)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或者免疫印跡）檢測之前部分提純分子。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide， EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆技術操作。

瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

瓊脂糖DNA是大多數分子生物學技術都要用到的實驗手段，可謂是一種常規技術，其原理主要是電場中在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

因此決定DNA電泳遷移率的因素包括：
1、 DNA的分子大小；

2、 瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%， DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、 DNA分子的構象

DNA分子處于不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

  4、 電源電壓

在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、 離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。

目前DNA電泳技術已經有30年未曾進行改進了，這項ZL里，研究人員通過反復的實驗，發現化合物硼酸鋰（lithium boric acid）是用于DNA電泳分析的理想溶液。

上面提到，在電泳過程中，溶液傳導電流從而使得帶有負電荷的DNA分子實現分離。DNA被放置于凝膠中，小型的DNA移動速度要比大型DNA快。

研究人員發現，硼酸鋰是一種比現有的使用了超過30年的溶液更好的緩沖劑，Brody說，“我們證明人們已經使用了30年錯誤的緩沖液，這些標準緩沖液更貴，也更慢”。

另外他也表示“傳統方法需要一個半到兩個小時的過程現在只需要10分鐘。在某些時候它能將速度提高10倍。這是一個對科學有著廣泛影響的發現。”

“我們的發現不僅僅對腫瘤研究有用，同時還對神經科學、發育生物學以及每個需要DNA分析的領域有影響。”他說，“但是如同科學中的所有事物一樣，這一技術還需要時間來得到驗證——科學家們與其它普通人一樣不喜歡改變。”

附：
DNA電泳常見問題分析
（轉載自丁香園） 問題

Pancreatic Cancer Researcher Jonathan Robert Brody, Ph.D., Joins Surgery Department at Jefferson

Pancreatic cancer researcher Jonathan Robert Brody, Ph.D., has joined the Department of Surgery at Jefferson Medical College of Thomas Jefferson University as assistant professor of surgery.

Prior to joining Jefferson, Dr. Brody served as an instructor at the Johns Hopkins University in advanced programs in biotechnology.

Currently, Dr. Brody is attempting to utilize the genetic understanding of pancreatic cancer to provide more rationale drug treatments. The studies include optimizing the common chemotherapeutic 5-fluorouracial and other drugs that can take advantage of mutations found in the majority of pancreatic cancers. The main goal of Dr. Brody’s laboratory is to understand the basic properties and defects of pancreatic cancer so he can translate this understanding to optimize the use of chemotherapeutics.

“It is our hope that, in the near future, his research will provide critical information to clinicians about how to rationally treat pancreatic cancer patients based on the individual characteristics of each patient’s tumor,” said Charles J. Yeo, M.D., Samuel D. Gross professor and chair of surgery at Jefferson.

While at Johns Hopkins, Dr. Brody took a postdoctoral position in oncology, training under the mentorship of Scott Kern, M.D., a world expert in the genetics of pancreatic cancer. With Dr. Kern, Dr. Brody revolutionized a basic molecular biology technique, DNA electrophoresis. Dr. Brody developed a low-molarity conductive media that is now being used worldwide to help speed the process time behind genetic based studies. Some predict this could speed up genetic research over five-fold. He also was Chief Graduate Student for the Department of Pathology at Johns Hopkins University in 2002.

In 2003, Dr. Brody received the Excellence in Basic Science Research honor from the Pathology Department for the fourth and fifth Annual Young Investigator’s Day and the Experimental-Pathologist-Trainee of the Year from the American Investigative Society for Pathology. Dr. Brody is the author of nearly two dozen peer-reviewed publications.

Dr. Brody earned a bachelor of arts degree in history from Skidmore College in Saratoga Springs, N.Y. in 1992 where he was a prestigious Filene Music Scholar for four years and a doctor of philosophy degree in pathobiology from The Johns Hopkins University School of Medicine in 2002. His thesis included cloning and defining a gene family linked to the process of prostatic and breast tumorigenesis.