瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中DNA的回收（電洗脫至透析袋）

限制性內切核酸酶 DNA 樣品

乙醇 EB 或 SYBR Gold 染色液 酚 氯仿 乙酸鈉 TBE 電泳緩沖液

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠 煮過的透析袋 透析袋夾 水平電泳槽 手提式長波紫外燈

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇

EB 或 SYBR Gold 染色液

酚：氯仿（1:1 , V/V)

乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)

0.25X TBE 電泳緩沖液

含 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 0.25 X TBE 電泳緩沖液

2. 酶和緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 樣品

5. 專用設備

煮過的透析袋

透析袋夾

水平電泳槽

手提式長波紫外燈（302 nm）

二、方法

1. 消化可以獲得至少 100 ng 的目的 DNA 片段。在適當濃度的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺中進行電泳分離，用含有 0.5 μg/ml 溴化乙錠或 SYBR Gold 染色。用手提式長波長紫外燈確定所需條帶的位置。

2. 用一鋒利的手術刀片或剃刀片，切下含有目的條帶的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠切片，置于用 0.25X TBE 濕潤的方形石蠟膜上。盡可能使切下的瓊脂糖體積最小，以減少抑制劑對 DNA 的污染，并縮短 DNA 遷移出凝膠的距離，同時也保證能容易地將其放入透析袋中。

3. 切下條帶后，進行照相，以獲得洗脫條帶的記錄。

4. 戴上手套，用透析袋夾將透析袋一端封住。用 0.25X TBE 充滿透析袋直至激出，拿住袋頸，輕擠透析袋以打開袋口。用藥勺將凝膠切片轉移至充滿緩沖液的透析袋中。

5. 使凝膠切片沉至袋底。去掉大部分緩沖液，留下足夠液體以使凝膠切片始終保持與緩沖液接觸。然后就在凝膠切片上方用透析袋夾將袋夾緊，避免存留氣泡和夾碎凝膠切片。在透析袋夾上用記號筆標記上 DNA 片段的名字。

6. 把透析袋浸泡在盛有一淺層 0.25X TBE 的水平電泳槽中。用玻璃棒或吸管防止透析袋漂浮，同時使凝膠切片的方向與電極平行。使電流通過透析袋，電壓通常為 7.5 V/cm, 持續 45~60 min。用手提式長波紫外燈來監測 DNA 從凝膠切片中遷移出來。

如果電泳時間太短，只有部分的 DNA 從凝膠切片中遷移出來，這樣會降低回收率。同樣，如果電泳時間太長，則會導致 DNA 附著到透析袋壁上。通常在 0.25X TBE 緩沖液中，電壓為 7.5 V/cm, 持續 45~60 min 就可以從凝膠切片將 0.1~2.0 kb 的 DNA 片段洗脫約 85%。



7. 倒轉電流的極性電泳 20 s，使 DNA 從管壁上釋放下來。切斷電源，從電泳槽中取出透析袋，輕揉它以便使 DNA 進入緩沖液。

8. 反向電泳后，打開透析袋夾，小心將凝膠周圍的所有緩沖液轉移至一個塑料管中。從袋內取出凝膠切片，如步驟 9 介紹的將其染色。用巴斯德吸管吸取少量 0.25X TBE 沖洗透析袋，將洗液加到塑料管中。

9. 將凝膠切片浸入含有溴化乙錠（0.5 μg/ml) 的 0.25X TBE 中，于室溫染色 30~45 min。在紫外線下檢査凝膠切片，確證全部 DNA 已被洗脫。

10. 通過 DEAE-SepHacel，或用市售樹脂層析，或用酚：氯仿抽提和標準的乙醇沉淀純化 DNA 片段。