生物技術常用實驗操作簡單介紹

一、總RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。

1.  提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 ╳106個細胞加1ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；

2.  將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；

3.  在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；

4.  取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；

5.  棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；

6.  讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；

7.  用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

二、瓊脂糖核酸電泳

1.  用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；

2.  根據欲分離DNA 片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；

3.  放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；

4.  室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；

5.  向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去；

6.  在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；

7.  接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；

8.  根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；

9.  電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。

瓊脂糖凝膠濃度  線形DNA的最佳分辨范圍（bp）

0.5%   1,000～30,000

0.7%   800～12,000

1.0%   500～10,000

1.2%   400～7,000

1.5%   200～3,000

2.0%   50～2,000

三、膠回收純化DNA

1.  瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；

2.  按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，45℃～55℃溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；

3.  取出純化柱，將上述溶解液轉移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；

4.  加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；

5.  重復操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；

6.  將純化柱放入一個新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7.  注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步驟不變。