生物標志物（Biomarker）的篩選與驗證

在與很多醫生和老師的交流過程中，經常會收到這樣的反饋：手上收集了很多臨床樣本，但是沒有具體方案，不知道怎么利用，樣本越收越多，冰箱越裝越滿，但最終這些樣本一直是在睡大覺，睡到死！針對于此，本期向大家推薦吉凱完整的Biomarker篩選方案。進一步可開發試劑盒，完成臨床轉化，造福于民；退一步可發表高分文章。

今年7月，國家科技部發布了《“精準醫學研究”重點專項2017年度項目申報指南建議》，建議指出“……建立多層次精準醫學知識庫體系和生物醫學大數據共享平臺，突破新一代生命組學大數據分析和臨床應用技術，建立大規模疾病預警、診斷、治療與療效評價的生物標志物、靶標、制劑的實驗和分析技術體系，形成重大疾病的精準防診治方案和臨床決策系統，建設中國人群典型疾病精準醫療臨床方案的示范、應用和推廣體系……”。

精準醫療的本質是通過基因組、蛋白質組等組學技術和醫學前沿技術，對于大樣本人群與特定疾病類型進行生物標記物的分析與鑒定、驗證與應用，從而精確尋找到疾病的原因和治療的靶點，并對一種疾病不同狀態和過程進行精確分類，最終實現對于疾病和特定患者進行個性化精準治療的目的，提高疾病診治與預防的效益。

生物標志物（Biomarker）是指可以標記系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生的改變的生化指標，具有非常廣泛的用途。不僅可從分子水平探討發病機制，而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優勢，可提供早期預警、預后療效分析、疾病精準的分期分型依據等，在很大程度上為臨床醫生提供了輔助診斷的依據。由此不難看出，Biomarker與精準醫療的理念不謀而合，在疾病的準確診斷上有著高度統一。

利用不同組學技術通過高通量篩選尋找不同疾病發生原因、早診、預后、分型等不同層面的Biomarker，對同一種疾病的不同狀態和過程進行精確分類，從而在此基礎上對于疾病和特定患者設計個性化精準治療方案。在這一層面看來，Biomarker是精準醫療的前提，精確的Biomarker對于后續針對不同疾病實施精準醫療有著非常重大的意義，因此，Biomarker早期篩選和后期Panel的建立與驗證就顯得尤為重要。

針對于Biomarker的篩選與驗證，吉凱整合多個平臺，開發了整體一站式服務，在提出臨床問題的基礎上，提供樣本與臨床資料，即可完成從篩選到驗證到試劑盒開發的整套流程。

臨床問題提出：臨床問題是Biomarker篩選的核心創新點，它可以是疾病的早診預判、藥物用藥后的療效分析，也可以是疾病分級判斷或是預后療效分析等等。但凡是在臨床上可以提出的問題，并且可以收取相應樣本，都可以作為Biomarker篩選的立足點。

臨床樣本分組積累與臨床數據積累：臨床樣本是Biomarker篩選的基礎，因此在提出臨床問題的同時，需要考慮可以收取的樣本量，從前期的篩選到后期的驗證都是需要足夠的樣本支持，一般來說年收樣本量最好在百例以上，樣本來源多種多樣，基本原則是無創或是微創的樣本優先考慮，全血、血清、血漿、尿液、唾液、組織、腦脊液甚至FFPE都作為篩選樣本。對于分組來說，至少有對照組與實驗組，比較嚴謹的方案往往還會將實驗組進行細分以及加入輔助分組。此外臨床信息也十分重要，患者的臨床資料、病理診斷結果、隨訪記錄……這些臨床信息是后期建立診斷Panel的基礎，可以大大提高Biomarker的可靠性。

高通量篩選和數據分析：依據樣本條件及個人興趣選取相應的高通量篩選方法，從組學層面考慮，可以是基因組、轉錄組或蛋白質組，從篩選方法考慮，可以是測序、芯片、質譜等等。通過高通量手段獲得的數據是非常龐大的，這時就需要擁有強大的生物信息學團隊對原始數據進行分析，從中挖掘出有價值的東西（候選Biomarker）。

中低通量技術擴大樣本驗證：經過高通量篩選與生信分析，將挖掘出來的候選Biomarker再回歸臨床進行中低通量的擴大樣本驗證。不同層面的Biomarker可選取不同的方法，SNP/SNV用Sequenom，表達量、表觀marker、CNV用qPCR，蛋白類可以用ELISA、western及IHC等方法。理論上講驗證樣本數量越多越好，一般至少在百例左右。

新檢測試劑盒開發： 獲得Biomarker之后結合生物信息學分析建立診斷Panel，開發臨床檢測試劑盒，并進行臨床檢測，驗證Panel的有效性。

篇幅受限，下面列舉一個Biomarker篩選的經典案例：Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma。這篇文獻是由復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所樊嘉教授領銜課題組在2011年發表于Journal of Clinical Oncology。文中利用Agilent microRNA芯片篩選、RT-PCR驗證等方法在HBV相關肝癌患者血漿中篩選到了由7個microRNA組成的早期肝癌診斷分子標記物，該檢測方法對小于2cm的HBV相關肝癌診斷準確率接近90%，效果明顯優于傳統檢測方法。

按照Biomarker篩選整體方案解析一下這篇文獻。第一，提出的臨床問題為HBV相關的肝癌早診，目標明確；第二，臨床樣本為微創收集的血漿，良好的Biomarker來源，且有詳細的臨床信息，對于分組來說除了對照組（正常人）和實驗組（HBV相關肝癌患者）之外，還加入了輔助分組慢性乙型肝炎和肝硬化，設計嚴謹，有效排除可能存在的干擾；第三，利用miRNA芯片篩選到15個差異miRNA；第四，利用qPCR在407例樣本中進行中低通量驗證15個差異miRNA，縮小靶標miRNA范圍至7個；第五，結合臨床數據，重新進行生物信息學分析，建立Panel，再于390例樣本中驗證Panel的有效性，發現使用該panel對HBV相關肝癌早診有效率高達94.1%，此外，區分區分肝癌與慢性乙型肝炎的準確率達84.2%，區分肝癌與肝硬化的準確率達88.4%。

Biomarker作為最直接快速有效的診斷手段，其篩選與獲得可在疾病診斷、發展、治療、以及療效監測等多個方面發揮重要的作用。近年來尋找和發現有價值的Biomarker已經成為目前研究的一個重要熱點。精準醫療是醫學的未來發展方向，包括精準預防，診斷，治療和預后四個層面。精準醫療發展關鍵在于Biomarker的發現與臨床實踐。

各位手頭有臨床樣本的老師，趕快行動起來，別再讓您的樣本睡大覺。