生物物理所等揭示Cas9切割DNA及其被AcrIIC3抑制的分子機理

　　CRISPR/Cas系統是廣泛存在于細菌和古菌中抵抗病毒、質粒等外源核酸的獲得性免疫系統。II型的Cas9在RNA的介導下可以特異性識別、切割dsDNA，具有可編輯性，因此被廣泛用作基因編輯工具。由于其重要性，Cas9被系統地研究，大量的文獻報道了Cas9的原子分辨率結構、單分子測量結果、分子動力學模擬計算結果，闡明了Cas9切割DNA的分子機理。但是，之前發表的Cas9結構中，切割目的DNA的HNH催化口袋遠離切割位點，Cas9處于非活性的狀態。而活性狀態下的結構是真正理解Cas9切割DNA的作用機制所必需的。另外，目前被廣泛使用的SpyCas9，因受其大小的限制，很難與sgRNA一起通過單一AAV病毒導入。而近年來新鑒定的NmeCas9則由于其相對比較小和脫靶率低的原因，有望成為一個更好的編輯工具，但其分子機制尚未被揭示。

　　噬菌體編碼的具有抑制CRISPR-Cas系統功能的蛋白被稱為anti-CRISPR蛋白，這些蛋白可以作為基因編輯開關，調控Cas9的活性。2016年，多倫多大學Karen Maxwell課題組首次報道了AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3三種可以抑制NmeCas9的anti-CRISPR蛋白。王艷麗課題組曾與Maxwell課題組合作闡明了AcrIIC2通過阻礙Cas9與sgRNA的結合抑制Cas9活性的機制；但是目前AcrIIC3的抑制機理還不清楚。

　　10月24日，中國科學院生物物理研究所王艷麗課題組的研究論文“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR Inhibited States”在Molecular Cell 雜志在線發表。該工作報道了NmeCas9的五種不同的狀態：sgRNA結合狀態、種子區域配對狀態、催化前狀態、催化狀態、切割后產物結合狀態的高分辨率結構。這些結構如同電影一樣，逐步展示了Cas9切割目的DNA的每一個過程，同時揭示了兩種不同的NmeCas9識別兩種不同PAM的分子機制，進一步揭示了Cas9切割DNA的分子機制。同時，該工作還報道了AcrIIC3分別與sgRNA結合狀態、DNA結合狀態Nme1Cas9的復合物結構，揭示了AcrIIC3抑制Nme1Cas9切割活性的分子機理。

　　Cas9與sgRNA結合形成功能復合物，然后Cas9-sgRNA復合物讀取目標DNA的PAM序列，解開目的DNA雙螺旋，同時sgRNA和目的DNA配對，產生R-loop，隨后Cas9的HNH與RuvC活性中心分別切斷DNA的兩條鏈。該研究中的種子區域配對狀態的結構，成功捕捉到雙螺旋形成的中間過程，即sgRNA識別、結合目的DNA的狀態（圖1A）。更值得注意的是研究者解析了Cas9 HNH處于催化狀態的結構（圖1B），并第一次觀察到金屬離子與HNH活性中心的結合。而上述這兩種狀態是首次被觀測到。

　　Cas9的HNH結構域具有非常高的柔性，并傾向處于遠離切割位點的部位，使得Cas9易處于非活性狀態。研究者對HNH結構域進行改造，增強了HNH結構域與目的DNA的相互作用，提高了NmeCas9切割DNA的活性。同時，HNH的催化狀態激活RuvC切割另一DNA鏈的活性。因此，HNH結構域改造后的Cas9切割目的DNA兩條鏈的活性同時得到增強。

　　為了闡明AcrIIC3抑制NmeCas9活性的分子機理，研究者解析了AcrIIC3和結合sgRNA的NmeCas9形成復合物的結構，以及和結合了sgRNA、DNA的NmeCas9形成復合物的結構。研究表明，兩個AcrIIC3單體連接兩個NmeCas9復合物（圖1C）。AcrIIC3與NmeCas9之間的相互作用將HNH結構域錨定在非活性狀態，從而抑制NmeCas9對DNA的切割。

　　這項工作還給大家展示了兩種NmeCas9切割DNA的中間狀態以及產物結合狀態，進一步闡述了Cas9切割DNA的分子機理。需要指出的是，在論文評審過程中，Nature Structural & Molecular Biology 雜志報道了處于切割后狀態的SpyCas9三元復合物結構，整體分辨率3.37angstrom，但是局部的HNH分辨率比較低。王艷麗組報道的催化狀態中Cas9三元復合物結構的分辨率更高，為Cas9的改造與應用提供了更有力的理論基礎；同時揭示了AcrIIC3抑制NmeCas9切割雙鏈DNA的分子機理（圖2）。

　　生物物理所研究員王艷麗和美國麻省大學醫學院教授Erik Sontheimer為論文的共同通訊作者。王艷麗課題組的孫偉、楊晶、程志為論文的共同第一作者。該研究得到科技部、國家自然科學基金以及中科院的資助，上海同步輻射光源（SSRF）及日本同步輻射光源（SPring-8）為該研究提供了重要的技術支持。

圖1. NmeCas9-sgRNA-DNA復合物三種不同狀態的晶體結構。A. 種子區域配對狀態；B.催化狀態；C. AcrIIC3抑制狀態。

圖2. NmeCas9切割DNA以及受AcrIIC3抑制的模型。