用大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段及單鏈 DNA 模板進行雙脫氧測序實驗
試劑、試劑盒 dATP去離子蒸餾水EDTA延伸 終止混合液和示蹤混合液甲酰胺上樣緩沖液Tris-Cl酶和緩沖液大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段核酸和寡聚核苷酸寡核苷酸引物單鏈 DNA 模板放射性化合物
儀器、耗材 離心機和轉頭微量離心管或微量滴定板
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
試劑、緩沖液，儲液的組成參見附錄 1, 儲液使用前稀釋到適當濃度。
dATP(0.1 mmol/L)
可選，參見步驟 4。
去離子蒸餾水
EDTA(10 mmol/L,pH8.0)
延伸/終止混合液和示蹤混合液
這些反應混合液可通過混合 dNTP 和 ddNTP 儲液制備，參見表 12-7。
甲酰胺上樣緩沖液
TM 緩沖液
100 mmol/LTris-Cl(pH8.5)
50 mmol/LMgCl2
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和緩沖液
大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段（5u/ul)
每一套四種雙脫氧測序反應大約需 2.5 單位酶。Klenow 片段通常保存在含 50% 甘油的緩沖液中。測序反應中過量使用酶會導致測序凝膠畸變，因為甘油與制備凝膠和凝膠電泳的標準緩沖液 TBE 中的硼酸鹽離子相互作用（請參見本方案末尾疑難解答）。
核酸和寡聚核苷酸
dNTP、ddNTP、dNTP(1 mmol/L) 和 ddNTP(5 mmol/L) 儲液
寡核苷酸引物
濃度約為 0.5pmol/ul(約 3.3ng/ul), 溶于水中。
對于一些結合于靶區域上游載體序列的通用引物，可參見第 8 章信息欄“通用引物”及本章末信息欄“DNA 測序寡核苷酸引物儲液制備"。
單鏈 DNA 模板
濃度約 0.05pmol/ul, 相當于約 0.15ug/ul 的 M13 噬菌體單鏈 DNA。
小規模制備 M13 噬菌體重組子單鏈 DNA 的濃度一般在 0.05 到 0.5ug/ml 范圍內。這取決于特定噬菌體的生校速度。在正常的測序反應條件下，模板 DNA 是過量的。因而每次測序反應中模板量上的微小變化并不影響測序結果的質量。可參見本方案末疑難答。
放射性化合物
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-33P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-35S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml) 或
5'32P 標記的寒核苷酸引物
若不用放射性標記 dATf 作為內標記，也可以用 5’端以 32P 標記的寡核苷酸引物進行測序反應。此時，可用 2ul(約 5x105cpm 約 0.5ng）放射性標記引物和 2ul 水代替反應中的未標記引物和 [32P]dATP(步驟 4), 其他的步驟相同。一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 轉移至寡核苷酸 5'端。詳細情況見第 10 章的方案 2。
離心機和轉頭
離心轉頭或用于 0.5 ml 微量離心管的銜接頭，以及甩平式轉頭和微量滴定板架 (如 Sorvall 公司產品），聚苯乙烯泡沫或橡膠襯墊。
專用設備
微量離心管（0.5 ml) 或微量滴定板（柔韌，耐熱，每孔容量為 300ul 的 U 型底 96 孔扳）。
參見信息欄"微量滴定板'
方法
1. 在 0.5 ml 微量離心管或微量滴定板孔中加入：
單鏈模板 DNA(0.1ug/ul) 5ul
寡核苷酸引物（1ug/ml, 約 160pmol/m]) 4ul
TM 緩沖液 1ul
2. 封閉試管的頂端或密封微量滴定板，在 55°C 溫育反應混合液 5~10 min, 使寡聚核苷酸引物與 DNA 模板退火。若有必要，退火的模板和引物可在-20°C 下保藏幾個月。
3. 用字母 C、T、A、G 標記四個微量心管或 96 孔 U 型微量滴定板上四個毗連的小孔; 然后在每個小管中加入 4ul 相應的 ddNTP 延伸/終止混合液（例如在標記 C 的微量離心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddCTP 混合液，在標記 T 的微量離心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddTTP 混合液等)。
4. 把退火后的引物模板溶液放在冰上并加入：
[α-32P]dATP 或 [α-33P]dATP 或 [α-35S]dATP 1ul
Klenow 酶（約 2.5 單位） 1ul
0~1 mmol/LdATP(如使用 [α-32P] 或 [α-33P]) 1ul
或
水（如使用 [α-35S]dATP) 1ul
Klenow 酶應儲存在不要使其升到室溫。酶在冰桶中幾小時會喪失活性。
5. 取步驟 4 的混合液 3ul 加到每一個 C、T、A、G 管的管壁上或微量滴定板孔的邊上。不要讓放射性標記混合液與 ddNTP 延伸/終止混合液接觸。加入的液體應掛在管或孔靠近邊緣的壁上。
6. 把小離心管放入微量離心機內（用合適的轉頭或適合 0.5 ml 離心管的銜接頭，或把它們放入去蓋的 1.5 ml 離心管中），或者把微量滴定板放入配有合適銜接頭的離心機中，以 2000r/min 轉速離心 C、T、A 和 G 各管或滴定板幾秒鐘，混合反應物。開始延伸/終止反應。37°C 溫育 10~12 min。
在室溫至 37°C 溫度范圍內.Klenow 酶都能很好地催化延伸/終止反應和示蹤反應。
7. 溫育后，沿每一個 C、T、A、G 管或孔壁加入 1ul 的示蹤液。總共溫育 10~12 min 后，離心 2s, 使示蹤液混入到延伸/終止反應液中。再在室溫下溫育 10~12 min。
8. 第二次溫育 9~11 min 后，沿每一個 C、T、A、G 管或孔壁加入 6ul 甲酰胺上樣緩沖液。不要讓溶液滑入聚合反應液中。溫育結束，離心微量離心管或微量滴定板終止測序反應。
9. 反應物在-20°C 時可最多保存 5 天，也可以用變凝膠電泳直接分析見方案 8、9 或 10、11 和 12)。熱變性后（100°C,2 min), 在冰上快速冷卻。取 C、T、A 和 G 反應物各 3ul 加入測序凝膠各孔中。