用經典RACE擴増3末端cDNA實驗

dNTP 溶液二硫蘇糖醇TE反轉錄緩沖液RNA 酶 HRNasinSuperScriptⅡ逆轉錄酶poly(A)+RNA 或總 RNAQT 引物Hercules Hot-Start 聚合酶

水浴或加熱儀熱循環儀

試劑

可以從多數大供應商那里買到該過程所需要的材料與合適的 5X 酶反應緩沖液或 10X 酶反應緩沖液。SuperscriptⅡ逆轉錄酶和 RNA 酶 H 可以從 Invitrogen 買到，RNasin 可以從 Promega Biotech 買到，Hercules 熱穩定性 Hot-StartDNA 聚合酶可從 Stratagene 買到，Tdt 可從 Invitrogen 或 BoehringerMannheim 買到。按照供應商的說明使用酶。有多種不同的熱穩定性 DNA 聚合酶，任何一種都是可用的，研究者應該尋找最有效的擴增（參照可靠性或價格）。來自 BoehringerMannheim 的方案是另一個很好的選擇。圖 25-2 的注解中列出了寡核苷酸引物序列，除Q_T 需要純化以確保它們全都是全長序列外（大部分引物合成公司都提供這一服務），其他引物都可以「不加工」使用。100mmol/L 的 dNTP 溶液可以從很多供應商處買到。

這一實驗方案分為兩個階段。

第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板
第 2 階段：擴增

第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10 mmol/L)

二硫蘇糖醇（DTT)(0.1mol/L)

TE(10 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和緩沖液

反轉錄緩沖液，5X(制造商提供）

RNA 酶 H

RNasin

SuperScriptⅡ逆轉錄晦（Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

poly(A)+RNA 或總 RNA

Q_T 引物（100ng/ul)

4. 特殊設備

預設為 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加熱儀

二、方法

1. 在一個無菌的離心管中，于冰浴上混合以下轉錄成分。

反轉錄緩沖液，5X                  4ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)         1ul

DTT(0.lmol/L)                          2ul

Qt 引物（100ng/pl)                0.5ul

RNasin(40U/ul)                       0.25ul

2. 在另一個管中，加1ul Ply(A)⁺RNA 或 5ug 總 RNA 至 13ul 水中，80°C 溫育3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s。
優先選用 Ply(A)⁺RNA 進行反轉錄，以降低反應背景，但如果僅有總 RNA，也沒有必要制備 poly(A)⁺RNA。

3. 將 RNA 加入到反轉錄組分中，然后加1ul(200U) 的 Superscript Ⅱ逆轉錄酶，室溫溫育 5 min,42°C1h,50°C10min。

4.70°C 溫育 15 min, 使逆轉錄酶失活，離心 5s。

5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H，37°C 溫育 20 min, 以消化 RNA 模板。

6. 用 TE 將反應混合物稀釋到 1ml，4°C 保存（這就是 3'末端 cDNA 文庫）。



第 2 階段：擴增

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10 mmol/L)

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和緩沖液

Hercules Hot-Start 聚合酶 (Stratagene)

Hercules Hot-Start 聚合酶緩沖液（10X)

3. 核酸和寡核苷酸

由第 1 階段得到的 3'端 cDNA 文庫

寡核苷酸引物 Q₀、Q₁、GSP1 和 GSP2(25pmol/L)(Q₀ 和 Q₁ 見圖 25-2)

4. 特殊設備

可設程序的熱循環儀

二、方法

1. 第一輪

(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中，混合以下成分。

Hercules Hot-Start 聚合酶緩沖液（10X)       5ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                               1.0ul

HerculesHot-Start 聚合酶                              2.5U

H₂O                                                             至 50ul

(2) 加 1ul 的 3'末端 cDNA 文庫（來自第 1 階段第 6 步），GSP1 和 Q₀ 引物各 25pmol。

(3) 混合均勻，在一個 DNA 熱循環儀上 98°C 加熱 5 min，使第一鏈產物變性并激活聚合酶。冷卻至合適的溫度（56~68°C) 退火 2 min，72°C 延伸 40 min。

(4) 按下列程序進行 30 輪擴增循環。



2. 第二輪

(5) 用 TE 以 1:20 稀釋第一鏈的部分擴增產物。

(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 min 的延伸步驟，用 Q₁ 引物和GSP2 引物擴增 1ul 上述稀釋材料。