電化學發光免疫測定

電化學發光免疫測定（electrochemiluminescence immunoassay，ECLl）是電化學發光（ECL）和免疫測定相結合的產物。ECLI中標記物的發光原理與一般的化學發光（CL）不同，是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，實際上包括了電化學和化學發光2個過程。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發光反應，而CL是通過化合物混合啟動發光反應。在電化學發光免疫測定中應用的標記物為電化學發光反應的底物三聯吡啶釕，其衍生物N—羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過化學反應與抗體或不同化學結構的抗原分子結合，制成標記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分2個步驟進行。現以雙抗體夾心法測定TSH抗原為例介紹ECLI反應原理。

第l步：耦聯有活化的三聯吡啶釕衍生物即[Ru（bpy）3]2+N—羥基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗體和結合了生物素的TSH抗體與待測血清同時加入一個反應杯中孵育。

第2步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應杯中，再次孵育，使生物素與親和素的結合，將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心。

第3步，蠕動泵將形成的[Ru（bpy）3]2+抗體—抗原—抗體—磁珠復合體吸人流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的TSH抗體（與生物素結合的和與[Ru（bpy）3] 2+結合的抗體）也被吸出測量室。

緊接著，蠕動泵加入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ECL反應過程。發光劑[Ru（bpy）3]2+和電子供體TPA在陽極表面，可同時各失去一個電子而發生氧化反應，使2價的[Ru（bpy）3] 2+被氧化成3價，后者是一種強氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自由基TPA…，后者很不穩定，可自發失去1個質子（H+），形成自由基TPA·，這是一種很強的還原劑，可將1個電子給3價的[Ru（bpy）3）3] 2+，使其形成激發態的[Ru（bpy）32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發態的[Ru（bpy）3] 2+通過熒光衰減機制，發射出一個波長620nm的光子，重新生成基態的[Ru（bpy）3] 2+。該過程在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與[Ru（bpy）3] 2+的濃度呈線性關系，故可測出待測抗原的含量。

ECLI具有以下優點：①標記物可再循環利用，使發光時間更長，強度更高，易于測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，可達>104單位；④反應時間短，20min以內可完成測定；⑤試劑穩定性好，2～5℃可保持1年以上。目前ECLI不 僅可以應用于所有的免疫測定，而且還可用于DNA／RNA探針的檢測。