電泳法(三個主要的方法，步驟)

　　電泳法

　　電泳法是指帶電荷的供試品(蛋白質、核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其含量(%)的方法。

　　各電泳法，除另有規定外，照下述方法操作。

　　第一法 紙電泳法

　　1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。

　　常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出;兩側電泳槽A內的鉑電極D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。電源為具有穩壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。

　　2. 操作法

　　(1) 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7?H2O)

　　39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7?2H2O)4.12g，加水 4000ml，使溶解。

　　(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm 的濾紙，或根據電泳室的大小裁剪，并在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用。

　　(3) 點樣 有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點加供試品溶液，每點10μl,共3點，并留2個空白位置。干點法是將供試品溶液點于濾紙上，吹干、再點，反復數次，直至點完規定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。

　　(4) 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極，接通電泳儀穩壓電源檔,

　　調整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。

　　(5) 含量測定 剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，分

　　別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用 3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項下的規定測定吸收度，并按吸收系數計算含量。

　　第二法 醋酸纖維素薄膜電泳法

　　1.儀器裝置 電泳室及直流電源同紙電泳。

　　2.試劑 (1) 巴比妥緩沖液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g，加水溶解

　　使成1000ml。

　　(2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

　　(3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。

　　(4) 透明液 取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。

　　3.操作法 (1) 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無

　　光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。

　　(2) 點樣與電泳 于膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4～5cm為宜。

　　(3) 染色 電泳完畢，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液浸

　　洗數次，直至脫去底色為止。

　　(4) 透明 將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10～15分鐘，取出平鋪于潔凈的

　　玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度計上測定和作標本長期保存。

　　(5) 含量測定 未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法

　　測定，一般采用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對含量 (1%)。

　　洗脫法 將洗凈的膜條用濾紙吸干，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶，分別

　　浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中，振搖數次，至洗脫完全， 于一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位，同法操作作對照。先計算吸收值總和，再計算各蛋白組分所占比率(1%)。

　　第三法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白的原理是根據大多數蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉 (SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的凈電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白按分子大小分離。

　　1. 儀器裝置 恒壓或恒流電源、垂直板或圓盤電泳槽和制膠模具。

　　2.試劑

　　(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g與亞甲基雙丙烯酰胺1.6g，加水至

　　200ml，濾紙濾過，避光保存。

　　(2)分離膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml，用鹽酸調節pH值至8.8，加水至100ml。

　　(3)濃縮膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml，用鹽酸調節pH值至6.8，加水至100ml。

　　(4)電泳緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸鈉1.0g，加水至1000ml。

　　3.操作法

　　(1)制膠 用30%丙烯酰胺溶液-分離膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液(新鮮配制)-四甲基乙二胺-水 (5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分離膠液，灌入模具內至一定高度(剩余體積留作制備濃縮膠用)，用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯酰胺溶液-濃縮膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水 (0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳(如為圓盤電泳，用水封頂)，待濃縮膠液聚合后，小心除去樣品梳或水。

　　(2)對照品和供試品溶液的制備 照各藥品項下的規定。

　　(3)電泳 垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V，進入分離膠時調至150～200V，當溴酚藍遷移膠底處，停止電泳。圓盤電泳：調節電流使每管8mA。

　　4. 固定與染色

　　(1)考馬斯亮藍染色

　　①試劑 a.固定液 稱取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水

　　至 500ml。b.染色液 稱取考馬斯亮藍R<[250]>0.5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml與冰醋酸50ml，再加水至500ml。c.脫色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，搖勻。

　　②固定與染色 電泳完畢，取出膠片(條)，置固定液中30分鐘，取出膠片(條)，置染色液中1～2小時，用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中。

　　(2) 銀染色

　　①試劑 a.硝酸銀溶液 取硝酸銀0.8g，加水至4.0ml，將此溶液滴加到0.1mol/

　　L氫氧化鈉溶液20ml與25% 氨溶液1.5ml的混合液中，搖勻，用水稀釋至100ml。

　　b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。

　　c. 顯色液 取1%枸櫞酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。

　　d.終止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。

　　② 固定與染色 膠片浸在固定液中至少2小時后棄去固定液，用水浸洗至少1小時;膠片置1%戊二醛溶液中15分鐘后，用水洗2次，每次15分鐘;膠片置硝酸銀溶液中15分鐘后，用水洗3次，每次15分鐘;膠片置顯色液中，待各帶顯出后置終止液中。

　　5.計算

　　用卡尺或用掃描定位法測量溴酚藍指示劑和蛋白遷移距離(如為圓盤電泳還應測量染色前后膠條長度，垂直板電泳膠片厚度低于1mm，染色前后膠片長度基本不變)。按下式計算相對遷移率：

　　蛋白遷移距離 脫色前膠條長度

　　相對遷移率(R'<[m]>)=

　　脫色后膠條長度 溴酚藍指示劑遷移距離

　　(1)分子量 以R'<[m]>為橫坐標，標準蛋白的分子量對數為縱坐標，進行線性回

　　歸，由標準曲線求得供試品的分子量。

　　(2)純度 取膠片(條)，置薄層掃描儀，以峰面積按歸一化法計算。

　　(3)結果判斷 供試品主成分遷移率應與對照品遷移率一致