科學家建立基于膜透過熒光蛋白的鄰近細胞標記技術

　　1月3日，《美國國家科學院院刊》（PNAS）發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌組和復旦大學附屬中山醫院教授王立新合作完成的研究成果（Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein）。該研究利用表達膜透過性熒光蛋白的遺傳工具小鼠，建立了體內鄰近細胞標記技術，并利用該技術揭示了肝臟不同區域中內皮細胞的異質性。

　　細胞之間的相互作用對于多細胞生物體生長發育、穩態維持以及損傷修復等過程至關重要，但關于監測體內細胞互作的遺傳學技術鮮有報道。當前的遺傳學手段基本上是針對特定細胞自身進行操作，無法深入研究細胞之間的互作。因此，建立新型鄰近細胞標記技術對剖析生物體內細胞間互作及功能具有重要意義。

　　sLP-mCh是脂溶性標簽連接mCherry的融合熒光蛋白（Ombrato et al., Nature 2019）。sLP-mCh在供體細胞中表達后，會從供體細胞中釋放出去，并進入鄰近細胞，將鄰近細胞標記為mCherry+。基于sLP-mCh蛋白的特性，為了實現體內鄰近細胞標記，科研人員構建了基因敲入小鼠——R26-sLP-mCh-GFP和R26-sLP-mCh。研究以小鼠肝細胞作為供體細胞，表達sLP-mCh和GFP，檢測肝細胞周圍的其他類型細胞標記情況。研究在R26-sLP-mCh-GFP小鼠體內注射特異靶向肝細胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，當病毒進入肝細胞后，Cre重組酶表達并發生Cre-LoxP重組，移除R26-sLP-mCh-GFP位點中間的終止序列，肝細胞啟動表達sLP-mCh和GFP熒光蛋白，成為sLP-mCh的供體細胞。研究發現，肝細胞為GFP+mCherry+，同時能檢測到GFP–mCherry+的非實質細胞，其中肝臟中80%內皮細胞、76%免疫細胞以及54%成纖維細胞被標記。研究將這種由Cre誘導的細胞間蛋白標記技術稱為CILP。

　　肝臟的基本單位是肝小葉，肝小葉可分為三個區域（zone），各區域的肝細胞具有不同特性以及分子標記。一區的肝細胞圍繞著肝臟門靜脈，高表達鈣粘蛋白E（E-Cad）；三區的肝細胞圍繞著肝臟中央靜脈，高表達谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小葉二區位于一區和三區之間，由E-Cad–GS–的肝細胞構成。肝臟中的毛細血管是一類特化的血管網絡，稱為肝血竇內皮細胞，肝血竇內皮細胞和肝細胞發生著緊密的相互作用，肝臟不同區域的肝細胞可能會受到內皮細胞不同程度的影響。

　　進一步，研究以Mfsd2a+肝細胞為例闡明肝細胞及其鄰近內皮細胞之間的互作。當用他莫昔芬誘導雙基因型成體小鼠Mfsd2a-CreER；R26-sLP-mCh后，Mfsd2a+肝細胞啟動sLP-mCh的表達，成為供體細胞。研究發現，在門靜脈周圍出現聚集的mCherry信號，且存在mCherry+CDH5+細胞，表明Mfsd2a+肝細胞作為供體細胞表達sLP-mCh后，周圍的內皮細胞也被標記為mCherry+。研究發現，這部分內皮細胞主要分布在門靜脈周圍，在肝小葉一區中超過90%的內皮細胞為mCherry+，在二區中約30%的內皮細胞為mCherry+，在三區中幾乎檢測不到mCherry+的內皮細胞。由此可知，研究運用CILP技術，并結合Mfsd2a-CreER小鼠，實現了肝小葉內皮細胞的區域性標記，高效地標記了肝門靜脈周圍內皮細胞。

　　為了進一步分析肝臟中不同區域內皮細胞的差異，研究利用FACS將mCherry陽性和陰性內皮細胞分選并進行轉錄組測序。主成分分析顯示，這兩群內皮細胞分別成群，互相具有較大差異。門靜脈周內皮細胞的特征基因Dll4、Lama4、Msr1和Ltbp47在mCherry+內皮細胞中顯著上調，中央靜脈周內皮細胞特征基因Rspo3、Wnt9b、Cdh13和Thbd7在mCherry–內皮細胞中顯著上調。研究對差異基因進行熱圖分析顯示，與血管新生、調節細胞黏附和生長因子應激相關基因的表達在mCherry+內皮細胞中顯著上調，而與胞外基質組成、化學趨化和組織形態發生相關基因的表達在mCherry+內皮細胞中顯著下調。

　　綜上，科研人員開發了體內鄰近細胞標記新技術CILP。CILP利用一種細胞膜透過性的熒光蛋白，當這種熒光蛋白在供體細胞中表達后，可以釋放到細胞外，并進入鄰近細胞，從而實現對鄰近細胞的標記。該研究利用CILP技術標記了小鼠肝臟中肝細胞的鄰近細胞，并利用Mfsd2a+肝細胞作為供體細胞，標記并分析了肝臟門靜脈周內皮細胞的特征。

　　研究工作得到中科院、國家自然科學基金、科技部、上海市科學技術委員會等的資助，并獲得分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術平臺的支持。

（A）sLP-mCh熒光蛋白從供體細胞進入受體細胞；（B、C）遺傳工具小鼠構建以及實驗策略；（D-F）以肝細胞作為供體細胞表達sLP-mCh，肝臟中非實質細胞被標記為mCherry+；（G、H）sLP-mCh被用于在胰腺和心臟中標記鄰近細胞。