科研人員深度挖掘人類腸道宏基因組的古菌病毒

　　北京時間12月30日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所馬迎飛團隊在國際學術期刊《自然-通訊》（nature communications，IF=17.69）上發表了題為"Metagenomic analysis reveals unexplored diversity of archaeal virome in the human gut"的文章。該工作首次對來自人類腸道宏基因組的古菌病毒進行了深入挖掘及全面分析，揭示了人類腸道中古菌病毒組的多樣性，為人類腸道古菌病毒組的研究提供了前所未有的一瞥。

　　人類微生物組的組成和功能與宿主的健康密切相關。除了細菌外，腸道微生物群中的非細菌成員(古菌、真菌和病毒)也在微生物群落的動態演替以及人類的生理、免疫、疾病等方面發揮著重要作用。古菌是人體的共生微生物之一，它們曾在腸道，口腔和皮膚等部位被檢測到，與人類疾病密切相關。與細菌相比，古菌在人體內的豐度相對較低，而且大多不可培養，因此與人類相關的古菌經常被忽視。病毒控制著微生物群落的組成和代謝，侵染古菌的病毒在基因組序列和病毒粒子結構方面具有很高的多樣性。迄今為止，只有少數研究報道人類腸道內存在古菌病毒，因此，與人類相關的古菌病毒仍然神秘。隨著下一代測序技術的發展以及海量數據的產生，基于宏基因組學的方法有助于我們對人類的古菌組和古菌病毒組進行廣泛的研究。本文以人類腸道宏基因組數據為研究對象，利用生物信息學的方法，對古菌病毒進行深度挖掘，探究它們的多樣性及潛在功能。

　　人類腸道古菌病毒組的多樣性

　　研究表明約有90%古菌基因組包含CRISPR結構1， 因此CRISPR spacer-protospacer的匹配分析適用于古菌病毒序列的識別。為了對人類腸道中的古菌病毒進行全面搜索，團隊首先構建了人類腸道相關古菌spacer序列數據庫 (HGASDB, Human Gut Associated Archaeal Spacer Database)，并基于HGASDB和古菌病毒的特征基因構建了一套腸道古菌病毒的鑒定方法，從收集的2271個腸道宏基因組樣品中及6個公開的病毒數據庫中共鑒定出了1279種古菌病毒，構成人類腸道古菌病毒組數據庫 (HGAVD) (圖1a)。隨后，團隊對鑒定出的病毒代表序列進行質量評估，大多數 (67%) 病毒contigs的質量無法得到評估。與此同時，團隊基于對病毒序列的網絡分析以及病毒蛋白序列的注釋信息，對HGAVD中的病毒序列進行了分類學的分析，其中大部分序列 (68.4%) 無法被分類到任何已知的病毒類別，這些分析表明人類腸道中依然存在大量未知的古菌病毒。此外，團隊還將HGAVD中的病毒與公共的腸道病毒數據庫進行了比較(圖1d)，發現來自HGAVD的大多數病毒 (n=1,097； 86%) 均無法與公共數據庫中的病毒聚類到一起，這表明HGAVD對腸道古菌病毒組具有良好的代表作用。綜上所述，HGAVD極大地擴展了人類腸道中古菌病毒多樣性。

　　古菌病毒廣泛分布于人類腸道中

　　為了了解腸道古菌病毒在全球人群中的分布情況，團隊對1279條古菌病毒contigs在人類腸道樣品中的豐度情況進行了估計，主坐標分析 (PCoA) 和Anosim分析的結果顯示：腸道古菌病毒群落的組成在不同性別 (ANOSIM, r = 0.004, p = 0.306) 和不同BMI指數 (ANOSIM, r = 0.006, p = 0.201) 的人群中并無顯著性差異。然而，當以國家作為界限分析時，我們觀察到這些古菌病毒在各地表現出不同的多樣性(圖2a)。

　　團隊進一步調查了這些古菌病毒在所有腸道樣品中的檢出率，共有7種古菌病毒在人群中的檢出率>10%，雖然這些病毒被歸類到了7個不同的病毒簇(VCs)中，但它們的宿主均為Methanobrevibacter_A smithii (M.smithii)。就地理分布而言，這些古菌病毒在非洲人群中的檢出率較低，但在亞洲、歐洲和美洲人群中則具有相對較高檢出率 (圖2b)。在人類腸道中檢出率高于1%的古菌病毒共有712種，病毒序列IMG|UGV-GENOME-0271153在人群中具有最高檢出率 (72.2%)，該序列長度為40.51 kb，被評估為中等質量的基因組，侵染M.smithii古菌。該病毒基因組編碼46個基因，其中8個基因被預測為有尾病毒的功能基因 (圖2c)。此外，團隊從人類腸道樣品中共鑒定出13種smacoviruses，它們的長度分布在2.0~2.5kbp之間。這些病毒與古菌基因組上7個不同spacer序列相匹配，其宿主為Methanomassiliicoccus intestinalis 或Methanomassiliicoccus_A intestinalis古菌。與亞洲和美洲人群相比，smacovirus在非洲和歐洲人群中具有更高檢出率 (圖2d)。

　　M.smithii古菌的病毒在人類腸道古菌組中占主導地位

　　病毒能夠以多種方式影響生態系統及微生物進化，例如部分噬菌體能夠通過裂解宿主細胞改變微生物的群落結構和生態功能；一些噬菌體能夠劫持其宿主的代謝機制，改變宿主細胞代謝產物濃度；噬菌體也可以作為宿主之間水平基因轉移的載體2，因此，對于病毒宿主的預測以及病毒與宿主相互作用的研究也是理解病毒的關鍵步驟。為此，我們通過CRISPR spacer序列建立古菌與其病毒序列間的匹配關系，推斷出每種古菌病毒的可能宿主。不出所料，大多數 (n=1217，95.2%) 古菌病毒的宿主都是甲烷短桿菌(Methanobrevibacteria_A)，它也是古菌中的優勢屬 (圖3a)。然后，我們通過統計每個古菌屬對應的VC數量來衡量病毒的多樣性，其中，47個VCs只侵染M. smithii古菌，17個VCs只侵染M.smithii_A古菌，但有13個VCs與這兩種古菌均有關聯，反映了古菌病毒能夠跨種侵染宿主的特性。為了對古菌的跨宿主侵染情況進行更加詳細的研究，團隊構建了宿主與病毒關系網絡（圖3c），發現大約三分之一的腸道古菌病毒都具有廣泛的宿主范圍，并不局限于單一物種，這些分析為人類腸道微生物群中古菌病毒介導的基因流動網絡提供了全面參考。

　　此外，侵染M.smithii的病毒是人類腸道古菌病毒的一個主要分支，為了進一步探索有尾古菌病毒的多樣性，團隊以末端酶大亞基 (Terl, Large Subunit Terminase) 作為標記構建M.smithii古菌病毒的系統發育樹，以此來估計這些病毒的多樣性（圖3d）。以上基于Terl蛋白的系統發育分析擴展了M.smithii古菌病毒的多樣性，并定義了新的譜系。

　　古菌病毒基因組編碼廣泛的蛋白功能

　　雖然人類腸道中古菌的功能蛋白已被廣泛研究，但是對于腸道內古菌病毒蛋白的理解卻十分有限。為此，團隊從1279條古菌病毒代表序列上共預測出了97,208個編碼蛋白的基因，分別僅有 10.8%和 17.4% 的基因能夠與pVOG3數據庫及PHROG4數據庫中的基因相匹配，表明人們目前對人類腸道古菌病毒的潛在功能知之甚少 (圖4a)。

　　在所有鑒定出的腸道古菌病毒中，M.smithii古菌病毒的蛋白功能最為多樣，共包含了1034種不同功能的蛋白 (只考慮了被指定生物功能的蛋白) ，其中包括一些病毒特有的功能蛋白，例如與結構、包裝、裂解、DNA結合/調控和復制相關的蛋白，但其他一些古菌病毒則缺乏這些病毒特有的功能蛋白 (圖4b)。此外，團隊還對36條完整古菌病毒代表序列的基因組進行了研究 (圖4c)，其中23條序列攜帶PeiW（pseudomurein endoisopeptidase）基因，揭示了該基因對于病毒侵染產甲烷古菌的重要性。此外對33種有尾病毒基因組的分析結果表明，與人類腸道中的細菌病毒類似，溫和古菌病毒在人類腸道古菌病毒中占據主體地位。

　　在這項研究中，團隊對人類腸道中的古菌病毒進行了全面的宏基因組數據挖掘，本研究結果將為深入了解人體腸道內古菌病毒的多樣性和蛋白功能提供前所未有的見解，以供人們更好地了解人類腸道生態系統。

　　中科院深圳先進院馬迎飛研究員為該文章的通訊作者，實驗室已畢業碩士研究生李冉和助理研究員汪永明為文章共同第一作者。該研究得到了中科院先導B，中科院定量工程生物學重點實驗室，廣東省合成基因組學重點實驗室及深圳合成生物學創新研究院的資助。該研究也得到腸道微生物頭部企業未知君（XBIOME）研究團隊的支持和幫助。