管碟法測定抗生素效價

  一、目的和要求
　　1、了解管碟法的原理。
　　2、掌握二劑量法測定抗生素效價單位的技術和計算方法。
二、原理
　　抗生素的生物檢定是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標準，具有與應用原理相一致、用量少和靈敏度高等優點。管碟法是瓊脂  擴散法中的一種，已被各國藥典廣泛采用，作為法定的抗生素生物檢定方法。
　　當抗生素在菌層培養基中擴散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現透明的抑菌圈。根據擴散定律的推導，抗生素總量的對數值與抑菌圈直徑的平方成線性關系。
三、實驗材料
　　1、四環素類抗生素的標準品和樣品。
　　2、試驗菌：藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）。
　　3、培養基：250ml三角瓶分裝150ml LB瓊脂，150ml三角瓶分裝50ml LB瓊脂，50ml三角瓶分裝20ml藤黃八疊球菌懸液用培養液。
　　4、滅菌物品：培養皿，牛津杯（內徑：6.0±0.1mm，外徑：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸緩沖液  ，彎頭鑷子，15×150mm試管，瓦蓋。
　　5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平儀，游標卡尺。
四、實驗實施
　　1、配制標準品溶液
　　2、配制樣品溶液
　　3、制備菌懸液。
　　4、制備平板：
　　（1）取6套無菌培養皿，分別加入約20mlLB培養基后，置水平玻璃板上凝固，作為底層。
　　（2）另取冷卻至50℃左右的50ml LB培養基，加入1ml試驗菌懸液，迅速搖勻后，用10ml破口吸管取6ml混菌培養基倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固。
　　5、在培養基平板底部作好相應標記，用彎頭鑷子在每個培養皿中等距離放入4個牛津杯。
　　6、用滴管分別將高、低濃度的標準品和樣品溶液加入到牛津杯中，以滴滿為度，換上皿蓋。
　　7、將培養皿平穩送入恒溫箱，37℃下培養16～18h。
　　8、用游標卡尺測量抑菌圈直徑