納米顆粒與外泌體電鏡圖像的對比分析

各位外泌體領域的朋友們，你們是不是打到過這樣的電鏡圖？ 

如果打到過，那就來讀一下這個文章吧。讓我們一起學習一下如何識別電鏡下的外泌體。

外泌體是這幾年開始興起的一個朝陽領域，它是細胞分泌的一種直徑在30-100nm（另一種說法是 30-150nm）的膜泡結構，可以介導細胞間物質的交換和信息通訊。相信大家對這些早已耳熟能詳，筆者在此不多做贅述。外泌體的分離是困擾剛剛進入該領域研究者的主要問題，從分離角度講目前大家分離外泌體主要通過一下集中手段：差速超速離心法、梯度密度離心法、沉淀試劑盒、凝膠排阻分離法、膜親和試劑盒等手段，后兩者主要用于同時分離所有的胞外囊泡組分。以上諸多分離方法中，梯度密度離心的分離方法是公認可以得到最高純度的分離方法，但是操作相對復雜，目前使用并不廣泛。以目前的手段來說，我們很難拿到純的外泌體組分，而多是以外泌體為主要組分的胞外微囊泡，筆者在這里對兩者不做過多區分。關于分離的一些經驗技巧，朋友們可以參考 “外泌體之家” 分離鑒定板塊的相關貼子，筆者適時在以后的文章中會詳細展開。

外泌體的鑒定是既分離后又一個困擾研究者的問題，一般研究者需要通過透射電鏡觀測樣本中是否存在外泌體樣結構（通常為茶托型或一側凹陷的半球形），通過粒子直徑分析系統測算和統計樣品中粒子的直徑分布，通過western blot檢測樣品中是否有外泌體相關marker蛋白的富集。另外，當電鏡圖觀測到的樣品結構不是典型外泌體樣結構時，還需要增加免疫膠體金電鏡進行驗證。本文筆者將通過納米顆粒與外泌體電鏡圖像的對比來總結外泌體電鏡圖的鑒別方法，爭取讓大家明白為什么外泌體電鏡需要看到具有膜結構的茶托樣納米粒子才能算是看到了外泌體。

讓我們先來看一張經典的外泌體電鏡圖：

Théry, Clotilde, et al. "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Current protocols in cell biology(2006): 3-22.

這是外泌體領域的大牛Thery在2006年發表的外泌體分離鑒定手冊上的圖樣。可以看到，電鏡視野中大多是略小于100nm的具有清晰膜的茶托樣結構，小圖中顯示免疫膠體金會附著到這些膜結構表面。同時thery提供了詳盡的電鏡制樣protocol。當然通常來說我們在論文里秀圖的時候不需要制作如此精美的電鏡圖，通常我們只需要做一個負染電鏡，并且可以外泌體結構即可。下圖是“外泌體之家” 電鏡板塊一些朋友秀出的比較典型的樣圖。

Dqq圖    hzangs圖

一般來說，paper里電鏡驗證樣品中分離得到的是外泌體，有上面這兩張圖的質量即可。可以看到，這兩張圖具有明顯的膜，立體結構清晰，同時具有茶托樣或凹半球樣結構。

看完這些圖，基本上大家對外泌體的電鏡圖樣有了清晰的認識。下面，讓我們開始做一些對比，來看一下大家電鏡圖中打到的其他結構可能是什么。筆者對其他領域的東西了解不多，可能在圖注上可能與原文有些許出入，還希望懂的朋友多多指正。

Veterinary Diagnostic using Transmission Electron Microscopy大家猜猜這是什么？ bar：70nm  這個其實是腺病毒。

DARL M, Harrison P M, Bottke W. Expression in Escherichia coli of a secreted invertebrate ferritin[J]. European Journal of Biochemistry, 1994, 222(2): 367-376.
看這個，bar：50nm，看上去圓圓的是不是很像外泌體呢？ 其實這個是鐵蛋白結晶。

Veterinary Diagnostic using Transmission Electron Microscopy
這個看上去很像茶托，出了沒有明顯的立體結構，基本剩下的特點都和外泌體相符。其實，這個是皰疹病毒的電鏡圖。

Douglas T, Young M. Host–guest encapsulation of materials by assembled virus protein cages[J]. Nature, 1998, 393(6681): 152-155.
這個電鏡圖中b圖像極了外泌體，但是其實他們還是病毒，最大的區別就在于，這個粒子的直徑相比外泌體而言小了。有些試劑盒秀的電鏡圖類似這個。

Park C W, Yang H M, Lee H J, et al. Core–shell nanogel of PEG–poly (aspartic acid) and its pH-responsive release of rh-insulin[J]. Soft Matter, 2013, 9(6): 1781-1788.
很多使用沉淀試劑盒的朋友拿到了這樣的電鏡圖，甚至有些kit的官方網站掛出的電鏡圖都是這個樣子的，更有一些paper里的電鏡結果都是這個樣子的……但是呢，其實這個是PEG和一些蛋白的聚沉物。
看完這么多亂七八糟的電鏡圖是不是有點暈了呢，讓我們在看幾張CNS paper里的電鏡圖，回顧一下真正的外泌體長成什么樣子吧。
Fong M Y, Zhou W, Liu L, et al. Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis[J]. Nature cell biology, 2015, 17(2): 183-194.

Melo S A, Luecke L B, Kahlert C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015.

        綜合起來說呢，電鏡結果是需要有一定的經驗才能識別出是不是外泌體的。要記住，外泌體在電鏡下面應該是具有非常明顯膜結構的30-100nm （其實電鏡下會有很多200nm一下的外泌體）大小不一的茶托樣結構，而其他形狀的結構都可能是存在問題的。 有些理論認為，不同的電鏡圖是由于電鏡的型號造成的，其實筆者看來并不是這樣，電鏡結果的好壞很大程度上是由于樣品分離方法、樣品性質造成的，換句話說，我們拿著PEG聚沉物是永遠打不出經典的外泌體電鏡圖的，只有真正的通過PEG聚沉得到了外泌體才有可能看到外泌體的結構。

目前市面上包括 SBI在內的沉淀kit 可能都有這樣的結果，它們的沉淀量和粒子數目明顯高于超速離心的產量，但是電鏡圖卻遠沒有超速離心得到的樣品那么好，甚至一些kit官網的電鏡圖中都可以看到PEG聚沉物甚至看到一些病毒、支原體的“影子”。電鏡圖上的一些信息，可能可以解釋為什么沉淀試劑盒會有那么驚人的產量了。 當然，大家也不必糾結，其實對照組設置好了，實驗結果還是相對可信的。對于一些IF不算太高的雜志，對電鏡圖的要求還是比較低的，kit拿到的結果還是可以接受的。但是如果你是瞄準著10分以上的刊物在做課題的話，筆者建議你拿到了電鏡下有經典外泌體結構的樣品后再繼續試驗吧。