線粒體的分離與觀察

一、實驗目的

1. 初步掌握用差速離心法分離大鼠肝細胞線粒體的方法。

2. 學習并掌握高速離心機和勻漿器的使用方法。

二、實驗原理

線粒體(mitochondria)是真核細胞中產生能量的重要細胞器。細胞中的能源物質—脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過偶聯磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。

制備線粒體時，可將組織勻漿液懸浮在懸浮介質中進行差速離心法進行分離。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），大小不一的顆粒沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的粘度。在一個均勻懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中最先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次再分離。

懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在—定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意使樣品保持4℃，避免酶失活。

線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。

三、實驗用品

(一) 材料 小鼠12 只

（二）器材 冷凍高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍網、玻璃勻漿器、PH 計、高壓滅菌鍋等。

（三）試劑 氯化鈉、詹納斯綠B、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、甲醇、冰醋酸、雙蒸水、甘油、姬姆薩染料、KH2P04 、Na2HP04。

1．0.9%滅菌的生理鹽水。

2. 1%詹納斯綠B 染液，用0.9%滅菌的生理鹽水配制。

3. 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)：

0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10ml

0.1mol/L 鹽酸8.4ml

加重蒸水到100ml

加蔗糖到0.25mol/L。

4. 0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/L tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)

5. 固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)

6. 姬姆薩染液（原液）：Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，純甲醇33m1。先將Giemsa 粉置于研缽內中，加少量甘油研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h 令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。

7. 姬姆薩染液（應用液）：臨用時，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)作l0 倍稀釋。

8. 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：

l/15mol/L KH2P04 50ml

l/15 mol/L Na2HP04 50ml

四、實驗操作

1. 制備小鼠肝細胞勻漿實驗前小鼠空腹12h，拉頸處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預冷到0～4℃的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應分數次添加。勻漿液用200 目銅篩過濾備用。

2. 離心先將9ml 0.34mol/L 緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝勻勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍高速離心機按圖圖4-3 順序進行差速離心。差速離心提取鼠肝線粒體流程見圖4-3。
3. 分離物鑒定

(1) 細胞核取細胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴1 滴姬姆薩染液應用液染色10min。自來水沖洗，吹干，鏡檢。結果：細胞核呈紫紅色，上面附著的少量胞質及淺藍色碎片。

(2) 線粒體取線粒體沉淀1 滴涂片，滴加1%詹納斯綠B 染液染20min，覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。

五、實驗建議

1. 注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中進行。

2. 將勻漿液置于蔗糖溶液上層時要沿管壁小心加入，同時及時離心，以防勻漿液中的顆粒自然下沉過快，影響后面的離心分層效果。

3. 姬姆薩染液應用液要在實驗時臨時配制，效果較好。過期的應用液不可使用。