細胞周期如何檢測

碘化丙啶（propidium iodide, PI）檢測凋亡細胞
早期死亡細胞膜通透性狀態的不同是區分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入最終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質量大的與DNA結合的熒光染料（如PI）不能時入凋亡細胞內，而相對分子質量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區分和壞死細胞，細胞內DNA出現Hoechest 3342標記而不出現PI標記的為凋亡細胞。
主要操作步驟如下：①組織塊用0.25%胰酶消化30min~1h。②200~400目篩網過濾細胞，獲得單細胞懸液。③75％乙醇（-20℃預冷）固定細胞1h。④加入PI（終濃度50g／mL）和無DNA酶污染的RNA酶（終濃度50g／mL）1mL染色30min~1h。⑤流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡
細胞凋亡情況觀察及凋亡率檢測
培養48h后細胞分為兩部分，一部分行碘化丙啶( pI )染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞核形態變化。另一部分以胰酶消化后收集， 以1800r／min離心5min，棄培養基，用4℃預冷的PBS洗細胞2次，離心去PBS，加入 4℃預冷的70％的乙醇 4℃固定1h，離心棄去固定液， 用 4℃預冷PBS 3ml 洗細胞2次，加人1ml PI，4℃避光30mi n 。采用流式細胞儀檢測凋亡率。
流式檢測細胞周期
要點： 最關鍵的就是減少細胞碎片和單細胞懸液的制備！
1、細胞消化要理想，資料顯示最好消化時加EDTA，可使流式做的很漂亮；
2、細胞消化后不可吹打過度，減少細胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的細胞容易破碎；
3、 細胞用PBS洗滌離心，轉速不超過1000r/min，有文獻用800r/min；可考慮在此過程中用300目的尼龍網過濾一遍細胞（有人主張用鋼網，以 減少細胞與尼龍網粘連的損失，本人認為鋼網易損傷細胞，DNA外溢也會造成細胞粘連，所以在細胞數足夠的情況下，首選尼龍網）；
4、離心后的固定，標準做法是將細胞懸液加入預冷70％酒精，而不是向細胞中加酒精，這樣是為了減少細胞聚集，這一點很重要，很多人都忽視了！ 5、一般選擇4℃固定過夜；
6、加染液前的洗滌仍要注意離心轉速的問題；
7、 關于PI染液的組成及配方，應主要以文獻為主，PI（作用為DNA染色劑）的濃度從0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都見報道，響應的 求助顯示都可出良好結果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般濃度為50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透細胞膜使PI能進入細胞核。 8、檢測時細胞要達到1～2×106個細胞（實際檢測是1萬到2萬個細胞），為了既保持初始條件相同，又可搜 集到足夠的細胞，應選用多孔培養板，在搜集細胞時，濃度大、抑制強的組可多搜集些孔，以保證檢測的細胞數量。如果細胞數量太低，技師為了減少對流式細胞儀 的損傷，就會選擇高速流（一般的檢測用低速流，誤差小），檢測的質量就會大大下降，數據的說服力就下降了！