細胞計數與存活測試

實驗概要

1 計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。 

2 血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm² x 0.1 mm=1.0 x 10^-4 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以10⁴，即為每ml 中之細胞數目。 

3  存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

實驗材料

    0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 

    Erythosin bluish stain 

       取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline 

    血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip) 

    計數器(counter) 

    低倍倒立顯微鏡 

     粒子計數器(Coulter counter, Coulter Electronics) 

實驗步驟

1 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。 

2 取少許混合液(約15ml) 自血球計數盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或
  紅色- Erythrosin bluish)。 

3 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以10⁴ ，即為每ml 中細胞懸浮液之細
  胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。 

               4 大格*細胞總數x 2 x 10⁴ / 4= 細胞數/ml*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10^-4 ml 

4 若不用血球計數盤，可用Coulter counter 作自動計數，惟無法辨別死細胞或活細胞。 

5 范例：T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。 

    活細胞數/方格：55 ,62, 49, 59 

    死細胞數/方格：5, 3, 4, 6 

    細胞總數= 243 

    平均細胞數/方格= 60.75 

    稀釋倍數= 2 

    細胞數/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 10⁶ 

    細胞數/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 10⁶ 

    存活率：225/243﹦92.6 %