細胞計數及活力測定

　　一、原理

　　培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。

　　在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。

　　用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。

　　二、儀器、用品與試劑

　　1. 儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀(或分光光度計)

　　2. 試劑：0.4%臺盼蘭，0.5%四甲基偶氮唑鹽(MTT)、酸化異丙醇

　　3. 材料：細胞懸液

　　三、操作步驟

　　1. 細胞計數

　　① 將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。

　　② 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。

　　③ 靜置3分鐘。

　　④ 鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

　　細胞數/ml=4大格細胞總數/ 4×10000

　　注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

　　2. 細胞活力

　　① 將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

　　② 加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

　　③ 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

　　④ 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

　　3. MTT法測細胞相對數和相對活力

　　活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。

　　① 細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

　　② 沉淀加入0.5-1ml MTT，吹打成懸液。

　　③ 37℃下保溫2小時。

　　④ 加入4—5 ml酸化異丙醇(定容)。打勻。

　　⑤ 1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。

　　注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。

　　附：1、0.4%臺盼蘭染液配制：

　　1. 臺盼蘭 0.4克加雙蒸水至100 ml。

　　2. MTT配制：

　　MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎液中。4℃下保存。

　　3. 酸化異丙醇配制：

　　異丙醇中加入HCl使最終達0.04mol/L。