細胞質RNA提取實驗

實驗材料 RNA

試劑、試劑盒 PBS細胞裂解液SDS蛋白酶K酚氯仿異戊醇無水乙醇

儀器、耗材 離心機培養箱

實驗步驟

1.  對于單層培奍細胞

（1）每10 cm 培養皿培養的細胞，用冰冷PBS洗滌3次。

（2）每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細胞，轉移至冰浴的離心管中。

（3）300 g 離心5 min，棄上清，繼續冰浴。

2.  對于懸浮培養細胞

（1）300 g 離心5 min，棄上請。

（2）細胞以1/2原體積的冰冷重懸，再離心后棄上清。

3.  重懸細胞于375 μl  冰冷的細胞裂解緩沖液，并置冰浴5 min。

4.  于4℃在微量離心機中離心2 min，將上清移至一個潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋渦混合器上振蕩。

5.  加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃溫育15 min。

6.  加入400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，在旋渦混合器上振蕩用微量離心機離心，上清移至干凈的離心管中，重復抽提1遍。

7.  再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰，上層水相轉移至干凈的離心管中。

8.  加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液（pH7.5），再加無水乙醇，混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃過夜。

9.  用微量離心機4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉（pH5.2）冼滌沉淀。

10.  干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中，測A280和A260，其與的RNA可在-70℃貯存。