肝損傷與肝細胞凋亡

【關鍵詞】  肝細胞
    肝細胞凋亡的病理學特征為肝細胞的嗜酸性變，又稱嗜酸性壞死。表現為個別肝細胞胞漿的嗜伊紅性增強，胞核固縮直至消失，形成嗜酸小體（eosinophilic body），脫離肝細胞索墜入肝竇或竇間隙。周圍可出現CTL、枯否細胞，將凋亡小體吞噬、降解。嗜酸性小體主要出現在急性病毒性肝炎或慢性病毒性肝炎活動期，也可出現在藥物性肝炎。關于細胞死亡過程的研究，近年來已成為國內外生物學、醫學研究的一個熱點 ［1～3］。本文復習近年來有關肝損傷與肝細胞凋亡機制國內外文獻作如下綜述。

    肝細胞死亡可分為凋亡和壞死，二者在形態、發生機制以及概念上都有很大的差別。由體內、體外因素觸發的細胞內預存的死亡程序而導致細胞程序性死亡的過程稱為細胞凋亡（apoptosis,APO）。又稱程序性死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡屬于細胞自主的生理性死亡，主要表現為：細胞皺縮，細胞核染色質濃縮，胞核空泡狀，染色質DNA斷裂成片段，但細胞膜仍保持完整。凋亡常發生于生理環境。而壞死多由肝細胞受各種致病因素作用導致，表現為細胞腫脹，細胞膜喪失完整性，進而形成噬酸性小體或者溶解。肝臟中有許多刺激可啟動肝細胞的死亡，如缺血、再灌等引發的缺氧、活性氧代謝物、藥物等毒性化合物以及乙醇、藥物、病毒性肝炎等引發的TNF釋放和自身免疫型、藥物誘導及病毒性肝炎等誘發的Fas-L,Granzyme B等等。一些刺激啟動后需要死亡受體（death receptors）及細胞內信號機制的參與，從而引發程序性細胞死亡；而另一些刺激則可能繞過死亡受體參與的級聯反應或者直接嵌入級聯反應的下游起作用。

    肝細胞凋亡的過程，細胞凋亡是一種級聯反應。TNF-α或者Fas-L等配體可能引發凋亡，這些配體可與細胞表面的死亡受體結合，也可被細胞內的事件激活并插入級聯反應。肝臟中細胞的凋亡發生在各種細胞類型中，包括肝實質細胞、Kupffers細胞、內皮細胞和星狀細胞等。研究表明，多種類型的肝損傷，包括暴發性肝衰竭、病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝病以及肝臟腫瘤的發病機制都和凋亡密切相關［2］，因此，研究肝細胞的凋亡對各類肝病的治療有重要意義。

    胱冬肽酶（caspase）參與的凋亡途徑是細胞很重要的死亡途徑。 經典的凋亡級聯反應從死亡受體（death receptor）開始。死亡受體包含一個位于胞質內的死亡結構域（death domaine），死亡結構域可與適應蛋白（adaptor protein）結合形成骨架結構，并可使起始或效應胱冬肽酶自我活化。當Fas-L與Fas結合或TNF-α與TNF-R1結合后，單個的受體分子形成三聚體使死亡受體聚集成簇。然后Fas與Fas相關的死亡受體蛋白（Fas associating protein with death domain,FADD），TNF-R1與TNF受體相關的死亡受體蛋白（TNFR   associating protein with death domain,TRADD）結合，然后與FADD結合。FADD與caspase 8結合，使其活化。TRADD也與受體相互作用蛋白（RIP）和TNF受體相關因子2（TRAF2）等蛋白質結合。這些結合可活化激酶，繼而活化NF-κB等轉錄因子，從而激活相關基因的轉錄，使肝細胞對抗TNF-α引起的凋亡。

    在凋亡的級聯反應中，一類重要的物質就是胱冬肽酶（caspase）。這類蛋白水解酶的活性位點（active site）有還原型半胱氨酸（cys），水解位點位于底物的天冬氨酸（asp）殘基后。caspase在細胞內以無活性的酶原形式存在，它們可被分為3組：（1）與細胞因子產生相關的ICE-like caspase （如caspase 1,4,5,13）；（2）死亡信號或者啟動caspase，它傳送死亡程序，而并無不可逆水解蛋白質的功能（如caspase2,8,9,10）；（3）死亡效應或者執行caspase，它斷裂所選擇的底物，這樣，當細胞本身的修復系統不能發揮作用時，它就可以斷裂細胞骨架或細胞核。在不同的細胞類型中，凋亡有兩條不同的信號傳導途徑［3］：（1）啟動caspase被激活后，產生一強的信號反應，然后直接活化效應caspase；（2）當啟動caspase活化的程度不夠充分時，它需要一個放大過程，這一過程通常有線粒體的參與。當起始caspase作用于Bcl-2家族中某些成員（如Bid）或者神經酰胺使之被修飾，然后該分子（Bid或者神經酰胺）在線粒體分子上定位，改變線粒體外膜通透性，使細胞色素C和其他與凋亡相關的線粒體蛋白的前體如凋亡誘導因子（AIF）等由線粒體內釋放出來。細胞色素C與胞質骨架蛋白（如apaf-1）和procaspase9結合，這一復合物一般被稱作凋亡小體（apoptosome）。在ATP及其水解酶存在時，細胞色素C-apaf-1復合物寡聚化，使得procaspase9（信號caspase）自身活化，然后caspase9激活caspase3（效應caspase）。這樣促進了細胞凋亡效應相互的作用。

    線粒體與肝臟損傷:近年來關于線粒體的研究表明，線粒體在細胞死亡中起著關鍵的作用。線粒體功能障礙已成為肝臟損傷的一個重要機制，它在細胞凋亡以及壞死過程都起著重要的作用［4］。細胞色素C是線粒體釋放的前凋亡（proapoptotic）因素。在細胞質，細胞色素C與凋亡激活因子Ⅰ（apoptotic-activating factor-1）結合，再與ATP（或dATP）結合，激活caspase 9，然后激活caspase 3，caspase 3刺激凋亡的效應途徑，導致ADP-核糖聚合酶（PARP）斷裂，核小體間DNA水解，細胞皺縮，染色體邊緣化，核小葉形成。caspase 也參與線粒體釋放細胞色素C的上游過程。TNF-α和Fas-L與其受體的結合激活caspase8。Caspase 8斷裂Bid，然后定位至線粒體，誘導細胞色素C的釋放。線粒體的瞬時通透性孔道（MPT）［5～7］是線粒體內膜一種可由銅離子誘導的可逆性通道，它在跨膜線粒體蛋白釋放至胞液的過程中起到重要作用。MPT使得線粒體內外膜連接處一種復雜的蛋白質大通道開放，該孔道具有非特異性以及高傳導性，它允許分子量<1500U的分子自由通過，以達到平衡。該孔道的傳導性非常之大以至于當只有幾個，甚至只有1個孔道開放時就足以使線粒體去極化，氧化磷酸化解耦聯，線粒體嚴重腫脹，因此對細胞來說，MPT的開放可能導致致命的后果。在許多凋亡模型中，MPT與線粒體膜電位的嚴重破壞以及細胞色素C的釋放同時發生，這提示這些事件有一定的關聯。MPT不僅在程序性細胞死亡中起重要作用，而且也是壞死性死亡的關鍵步驟。因此，線粒體在多種細胞死亡形式中起到關鍵的連接作用。細胞若發生凋亡則需要未損傷的線粒體產生足夠的ATP方能維持，而MPT的快速發生將影響多數的線粒體，最終使ATP耗竭，氧化應激大量發生。所有這些都將抑制細胞的凋亡，但對由于離子梯度及鈣離子活化等功能的喪失造成的細胞腫脹以及溶解性壞死有促進作用。因此，廣泛的MPT可使線粒體功能大量喪失，繼而使細胞壞死。

    與死亡程序相關的另一重要成分是Bcl-2 家族［8］。這一家族的不同成員對凋亡或壞死可能具有促進或抑制兩種不同的作用，其主要作用靶點是線粒體。Bcl-2 家族成員或存在于細胞之中，或以非活性態與膜結合。其中主要的抗凋亡成分都是膜結合態的，有一些可與線粒體膜結合。它們的重要功能之一就是調節MPT。Bcl-2家族成員能形成同源或異源二聚體，不同的二聚體可能對凋亡產生不同的作用（誘導或抑制）［9］。除了形成二聚體外，某些成分還具有離子通道的作用，這對促進或抑制線粒體的腫脹具有重要作用。這一家族之間的相互作用及其復雜性提示尚有很多方面值得我們對其去研究。

    與肝細胞凋亡相關的基因有數十種，分為凋亡抑制性基因、促凋亡基因和雙向調控基因。三者處于動態平衡狀態，共同控制著細胞的增殖或凋亡。凋亡抑制性基因主要為Bcl-2，其抗凋亡機制主要為抑制線粒體釋放促凋亡因子、維持鈣穩定、抑制caspase活化、直接抗氧化及抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的細胞毒作用。促凋亡基因的代表為P53基因，主要在細胞周期的G1期發揮作用，如發現DNA有缺陷，則阻止細胞進入細胞周期，同時啟動DNA修復機制，如DNA損傷不可修復時，則啟動凋亡機制，將損傷細胞清除。當P53發生突變后，則失去促凋亡的功能。P53基因是促使腫瘤發生的癌基因之一。凋亡的雙向調控基因c-myc是一種癌基因，即能誘導細胞增殖，也能誘導細胞凋亡。

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