肺泡上皮細胞的分離步驟

一、取得完全無血液殘留的肺臟：

實驗前j將大鼠全身血液放凈，取得完全無血液殘留的肺臟

二、消化肺組織：

常用于細胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分離上皮細胞的酶，現在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩定，有效作用時間短暫，容易自我降解等問題。Dobbs L G等認為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細胞[9]。胰蛋白酶消化沒有選擇性，會帶來像內皮細胞和間質細胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質細胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細胞的純度和產量。與此相反，Cunningham A C等發現，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產量的Ⅱ型上皮細胞[10]。膠原酶可以用來輔助消化細胞間質。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒有文獻定量描述最優化的酶消化方法。Finkelstein J N等發現可以通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實驗中也證實了通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。

三、分離純化細胞：

上皮細胞的分離純化技術經過二三十年的發展日漸成熟，呈現多樣化的特點。目前對細胞的分離純化主要有以下幾種方法。

1、密度梯度離心：

密度梯度離心分離細胞的原理是不同細胞的沉降系數不同，在密度梯度離心中細胞所處的位置也相應不同。這是最早用于分離Ⅱ 型上皮細胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續梯度離心，豬肺泡Ⅱ型細胞最終純度可以達到70%～85%左右[11-12]。沉降系數與細胞的直徑和天然密度有關。由于Ⅱ型細胞與其他細胞存在密度和大小的交叉(如巨噬細胞)，僅僅通過離心并不能有效去除雜細胞。 Kikkawa(1974)讓巨噬細胞吞噬一些重顆粒(如硫酸鋇)，改變其密度，可以幫助區分巨噬細胞和上皮細胞。離心后的純度達到94%,但產量明顯減少[8]。上皮細胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細胞重疊的細胞層，這必然會造成某些密度大的Ⅱ型細胞損失，產量大大降低。

2、濾膜分離：

濾膜分離的原理是根據細胞的大小不同來進行分離。Ⅱ型上皮細胞約10μm，比巨噬細胞(約25μm)和Ⅰ型細胞 (50μm-100μm)小，用150μm孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30μm-40μm孔徑的濾膜除去全部Ⅱ型細胞和部分巨噬細胞[13]，采用 15μm的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡單，它和其他分離方法聯合使用可以提高純度。

3、流式細胞技術：

流式細胞技術分離的原理是根據不同細胞之間的熒光差異。根據不同種細胞的特征識別，用熒光物質標記篩選。上皮細胞內含有豐富的脂類物質，用親脂性熒光素標記，可以得到純度很高的細胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮細胞的單抗進行免疫熒光標記，再用流式細胞儀進行篩選，得到96%的Ⅱ型上皮細胞[14]。但熒光素對被標記細胞有害。Rochat T R等發現自然熒光和直角光散射可以區分巨噬細胞和單核細胞，這給不經熒光標記分離上皮細胞提供了可能[15]。流式技術分離細胞的產量很低，但純度極高。這種技術經過完善在將來會更有吸引力。

4、免疫黏附：

免疫黏附的原理是各種細胞的膜表面有不同的免疫活性物質。巨噬細胞和其他大多數非Ⅱ型細胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細胞懸液置于板上，巨噬細胞和其他大多數非Ⅱ型細胞因為含有Fc片段的受體而與IgG結合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型細胞被沖洗下來[16]。經過多年的摸索，這種方法近幾年已開始應用，簡便易行，可除去絕大多數的巨噬細胞，有效的提高上皮細胞的純度。

5、貼壁選擇：

貼壁選擇的原理是各種細胞完成貼壁的時間不同，這種特性用在培養時做篩選。根據最終目的，綜合其中幾種方法能達到較好的效果。例如先用濾膜過濾，再用IgG包被法。