腫瘤細胞誘導血管生成模型實驗

無論原發性腫瘤還是繼發性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。

腫瘤細胞

DEM 藻酸鈉 NaCl EDTA CaCl2 臺盼藍 甲醛

離心機 分光光度計 γ計數儀

1.  用DEM培養液洗滌對數生長期的腫瘤細胞，收集并重新懸浮細胞于DEM培養液中。

2.  懸浮的腫瘤細胞與1.2%藻酸鈉溶液混合，稀釋后的藻酸鈉濃度為0.8%，細胞濃度為（1~5）x10⁶細胞/ml。

3.  把0.8%藻酸鈉的腫瘤細胞稀釋液裝入噴霧器內，用力使液體壓出噴嘴。

4.  當水溶性的藻酸鈉與80 mmol/l CaCl₂混合，Na⁺被Ca²⁺取代后變成膠。

5.  空氣壓力和噴出的速度決定藻酸鈉膠粒的大小，可用培養液或0.15 mol/ NaCl漂洗膠粒。

6.  加入0.5 ml含有1%EDTA的0.9%NaCl溶液至0.5 ml 藻酸鈉包埋的細胞中。

7.  EDTA能破壞Ca²⁺與藻酸的結合鍵，使膠轉變成液體。

8.  臺盼藍測定腫瘤細胞。

9.  用50%的藻酸鈉溶液稀釋包埋細胞，以便在恒定體積內得到所需的腫瘤細胞數。

10.  用21號針沿腹白線皮下注射200 ul 藻酸鈉溶液包埋的腫瘤細胞，以藻酸鈉溶液作為對照。

11.  3~21天后，處死動物，從腹部皮下分離出藻酸鹽膠粒：

（1）10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，染色，進行組織化學和免疫化學檢查。

（2）諸葛將其稱重，于室溫下載水中浸泡、搖動過夜，采用Drabkin分析方法在分光光度計540 nm 測定上清液中的血紅蛋白含量。

（3）在處死動物前1 h，把⁵¹Cr標記的紅細胞從尾靜脈注射至小鼠體內。

（4）拉頸處死小鼠后，將分離出的藻酸鈉膠粒和遠離膠粒的一塊組織稱重，并用γ計數儀測定放射性。

血管生成機制復雜，參與并促進血管生成的因子也眾多，EMT腹腔液中巨噬細胞數量明顯增加，其分泌的TNF-α和IL-8可以促進血管內皮細胞的增殖，轉化生長因子-β（TGF-β），血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)，乙酰肝素酶，血管生成素(angs)，骨生成素(OPN) ，環氧化酶(COX－2) ，缺氧誘導因子-1，層粘連蛋白(LN) ，胎盤生長因子(PLGF) ，Survivin，促紅細胞生成素(Epo)均參與了EMT血管形成過程。

腫瘤血管生成是一個極其復雜的過程，一般包括包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。腫瘤血管生成的發生一方面是由于腫瘤細胞釋放血管生成因子激活血管內皮細胞，促進內皮細胞的增殖和遷移，另外一方面也是因為內皮細胞旁分泌某些血管生長因子刺激腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞和內皮細胞的相互作用自始至終貫穿于腫瘤血管生成的全過程。通常，腫瘤新生毛細血管是在原有的血管基礎上延伸擴展而形成的，其過程類似于典型的傷口愈合和胚胎形成過程。這些新生血管為不斷浸潤生長的原發腫瘤提供營養，反過來，腫瘤細胞在生長過程中又分泌多種物質以加速腫瘤新生毛細血管的形成。