膠體金及金標檢測技術研究進展

繼三大標記技術（熒光素、放射性同位素和酶）之后，一種固相標記免疫測定技術--免疫膠體金技術（Immune colloidal gold technique, ICG）逐漸發展起來。它是以膠體金作為標記物，利用抗原抗體特異性反應，對抗原或抗體物質進行定性乃至定量研究的標記技術。近年來，該技術因其操作簡便、觀察直觀、靈敏度高、價格低廉等優點在醫學、動植物檢疫以及食品安全監督等各領域均得到了廣泛的應用。

1.膠體金的制備

膠體金即金的水溶液，是指分散相粒子直徑在1-100 nm的金溶膠。由氯化金溶液在還原劑作用下，金離子還原成金原子，從而凝合形成特定大小的金顆粒，因其中正負離子組成膠粒的雙電子層結構，從而使溶膠處于穩定狀態，故稱膠體金。

1.1制備方法

膠體金制備大體可分為分散法和還原法兩種，目前多采用還原法制備膠體金，主要包括：白磷還原法，抗壞血酸還原法，枸櫞酸三鈉還原法，乙醇—超聲波還原法，硼氫化鈉還原法和鞣酸-枸櫞酸鈉還原法等方法。白磷還原法制得的膠體金顆粒直徑在3nm左右，顆粒大小均勻性好，但白磷易燃易爆，配置時需十分小心。枸櫞酸三鈉還原法在實踐中最為常用，工藝過程簡單，重復性好，而且可通過調整溶液中枸櫞酸三鈉濃度，來控制膠體金顆粒大小。乙醇—超聲波還原法在實踐中很少應用，一方面是由于工藝過程不好控制，重復性差，另一方面是所制金顆粒較小，除了免疫組化電鏡技術中用小顆粒膠體金外，免疫檢測技術中所用膠體金顆粒一般在50 nm左右。硼氫化鈉還原法在實踐中也很少應用，一方面是由于工藝過程不好控制，重復性差，另一方面是所制金顆粒較小，除了免疫組化電鏡技術等研究試驗使用外，金標免疫檢測技術中很少使用。鞣酸-枸櫞酸鈉還原法為常用方法之一，可通過鞣酸的濃度來控制膠體金顆粒大小。但要注意：鞣酸溶液一定要避光保存，溫度必須控制在60℃，否則會影響膠體金的均一性。

1.2影響膠體金制備的因素

除了嚴格的制備工藝技術外，玻璃器皿的潔凈度和水的潔凈度會直接影響膠體金制備效果，雜質污染會影響膠體金的均一性。玻璃容器用雙蒸水洗過后需做硅化處理，所有溶液必須用經0.45μm微孔濾膜處理的雙蒸水配置。

2 膠體金標記蛋白質

2.1 膠體金標記技術原理

膠體金的顆粒表面帶有較多的負電荷，能迅速而穩定的吸附帶正電荷的高分子物質（如抗體分子、植物凝集素和蛋白A）而不破壞其生物活性。因此，利用膠體金的物理學特性來標記一些生物活性物質作為免疫探針，用于免疫組化抗原定位及抗原、抗體檢測。

2.2 膠體金標記蛋白質影響因素

膠體金與蛋白質之間是通過正負電荷之間存在的范徳瓦爾引力相結合的，膠體金顆粒與蛋白質分子之間無共價鍵聯系。膠體金標記蛋白質過程屬于物理過程，標記體系的pH值、離子濃度及二者的比例等均可影響標記效果，一般情況下，當膠體金pH值接近或大于蛋白質等電點時，膠體金對蛋白質的吸附力最強。反之，當膠體金pH值低于蛋白質等電點時，則會凝集而失去結合能力。如在標記葡萄球菌A蛋白（SPA）時，SPA等電點是pI5.1，膠體金的pH值可選擇在pH5.9-6.2。標記單抗時，膠體金的pH值適宜在pH8.2。對于含有多種大分子蛋白的樣品，如多價抗體的標記，實際上很難滿足體系中各種蛋白分子的等電點的要求。為了取得較好的標記條件，可先將標記蛋白用低于pH9.0的緩沖液透析，膠體金的pH值調在pH9.0進行標記。

影響膠體金標記蛋白質是否成功的另一個重要因素是膠體金與標記蛋白質的用量比例。通常蛋白質的用量取決于膠體金的顆粒大小，金顆粒直徑越小，金顆粒所具有的總表面積就越大，可吸附蛋白質的量也就越大。由于膠體金制備過程中誤差會造成金顆粒的不均一性及不同蛋白質之間穩定點的差異，在膠體金蛋白質標記時，最好在每次實驗前都進行蛋白質最小穩定點測定，以保證能獲得最佳標記率。

2.3 膠體金標記蛋白質的分離純化

各種方法所得到的膠體金顆粒直徑，是大多數顆粒的平均直徑。實際工作中所得到的膠體金，是各種近似直徑顆粒的混合體，標記過程中，并不是所有金顆粒都可以得到穩定。因此，膠體金標記蛋白質后，必須進行分離純化，以除去未參與標記的過量蛋白質、未穩定的金顆粒及各種可能形成的聚合物。在膠體金標記蛋白質過程中，除嚴格控制膠體金的制備工藝外，標記后選擇合適的純化方法十分關鍵。金標蛋白質的分離純化與同位素、熒光素、發光劑及酶標抗體的純化方法不同，其主要特點是金標蛋白質的質量大，并以溶膠形式存在，對純化過程中的pH值、離子強度變化及某些雜質等因素較為敏感，不易采用鹽析、離子交換、親合層析等常規方法進行分離。目前主要采用超速離心和凝膠過濾兩種純化方法。

3.免疫膠體金快速診斷技術

提到膠體金快速診斷技術，不得不首先提到POCT。在臨床醫學檢測技術中，POCT（point of care testing，簡稱 POCT）是指任何由醫院專業人士或非專業人員，在檢測中心以外進行的檢測，簡稱為即時檢驗。它使煩瑣的檢驗過程得以簡化，取代了需要較高維護成本的傳統儀器設備。近年來，隨著微加工技術的發展和生物學領域的要求，發展易于操作、檢測信號易于判斷、試劑消耗量少、反應時間、自動化程度更高、儀器小型易攜帶、可實現高通量、大規模的檢測的POCT快速診斷技術已成為國內外研究的熱點。

目前，醫學檢驗中應用的免疫膠體金快速檢測技術主要有快速斑點免疫金滲濾法（DIGFA）和膠體金免疫層析法（GICA）兩種方法。這兩種方法都是以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標本后，經濾膜的毛細管作用或滲濾作用使標本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結合，再用膠體金標記物與之反應形成紅色可見結果從而達到檢測目的。

3.1膠體金免疫滲濾技術

Vakirs等于1985年建立了金標免疫滲濾技術，該技術原理是：先用膠體金標記二抗，隨后將抗原物質包被于醋酸纖維素或硝酸纖維束膜，最后采用特定形狀的塑料卡盒及吸水濾紙等組裝垂直滲濾裝置。反應過程是；先將檢測樣品（血清）加在反應膜上，若樣品中存在被檢特異性抗體，則檢測樣品快速滲濾通過反應膜時，樣品中的特異性抗體就會與包被于反應膜上的抗原結合，隨后用緩沖液滲濾洗去樣品中剩余的物質，再將金標二抗加于反應膜表面，當金標二抗在反應膜的滲濾過程中，金標二抗就會與結合于反應膜上的特異性抗體結合，最后用緩沖液滲濾洗去未結合的金標二抗。此時，反應膜上會顯示出紅色的點。若樣品中沒有被檢特異性抗體，則抗原抗體連鎖反應不成立，金標二抗不會留在反應膜，也就不會出現紅色的點。由于金標免疫滲濾技術操作簡單，反應速度快，2-3分鐘出現結果，特異性強，敏感性高，此項技術自誕生之日期，備受業界高度關注。Spielberg等于1989年建立了人類免疫缺陷病毒抗體檢測金標免疫滲濾檢測技術。金標免疫滲濾技術現已應用于醫學臨床檢驗，疫病預防、動物疫病防控，食品安全檢測及農業病蟲害檢測等領域。金標滲濾法的最大缺陷是金標抗體有效期短，一般為6個月。

3.2膠體金免疫層析技術

90年代初在金標滲濾技術的基礎上建立起了一種簡易快速的免疫學檢測技術，即金標免疫層析技術。其技術原理是：將金標抗體固化在玻璃纖維或無紡布上，同時在硝酸纖維素膜上包被一條檢測線及一條控制線，隨后一同和樣品墊、吸水墊及不干膠一起組合粘貼在塑料墊板上，再按一定規格切成檢測條。檢測時，樣品首先吸附在樣品墊，樣品在水平流動過程中將固化金標抗體溶解，并隨之通過硝酸纖維素膜向吸水濾紙端繼續水平流動，吸水濾紙會幫助樣品流動。若樣品中存在被檢測物質，測硝酸纖維素膜上包被的檢測線和對照線會同時顯色。否則，反應膜上只出現一條對照線。金標免疫層析技術快速、簡便、穩定性好，有效期可長達2-3年。Beggs等最先于1990年將此技術用于絨毛膜促性腺激素（HCG）檢測。隨后由膠體金代替膠體硒用于乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測，目前已廣泛應用于病毒、細菌、毒品及各種蛋白質的檢測，是目前臨床檢驗應用僅次于ELISA的一種重要的檢測試劑，但是檢測時間卻比酶免縮短近5倍，這大大促進了該方法的普及應用。