3.1 膜的分離
因為在研磨材料時，要分離的膜組分以小囊泡形式與可溶的胞質蛋白質混合在一起，所以，最好在分離、鑒定膜蛋白前將這些胞質蛋白質去除掉。為了達到這個目的，我們需要用可穿透這些囊泡的達到臨界微胞濃度（CMC) 的去垢劑溶液來分離膜組分( 見注釋 1) ，使包覆親水性蛋白質慢慢地向外擴散。增溶緩沖液還含有一種離液鹽和一種二價金屬螯合劑用來解離松散結合在膜周邊的蛋白質。這里所介紹的分離植物質膜的實驗過程見圖 22-1。
( 1 ) 將 0.5~5 mg 的膜組分懸浮在分離緩沖液中（濃度為：0.2 mg/ml) ，4°C 攪拌混勻。
( 2 ) 測試時間可長達 4 h。
( 3 ) 經過處理后，將膜懸浮液于 4°C，100000 g 離心 1h。
( 4 ) 測定上清液和沉淀的蛋白質含量。
( 5 ) 在 SDS-PAGE 上分析膜外周蛋白質組分（上清液）和膜內鑲嵌蛋白質組分 ( 沉淀）的條帶。
3.2 蛋白質增溶
分離膜鑲嵌蛋白質首先需要使用去垢劑打破其天然脂環境 [ 8，9] 。這里介紹的方法中，我們使用中性或兩性離子去垢劑，因為這兩種去垢劑不會修飾由 IEC 分離出來的蛋白質的電荷。而且這兩種去垢劑作用溫和，能保持蛋白質的天然構象與活性。
( 1 ) 用 1 ml 增溶緩沖液室溫下增溶 0.5~5 mg 分離出來的膜組分。
( 2 ) 添加 1 ml DM 溶液于增溶緩沖液中，使 DM/蛋白質比例（m/m) 達到 3~7 ( 見注釋 2) 。
( 3 ) 渦旋混勻 2 min，室溫下低速攪拌，增溶處理 2 h。
( 4 ) 室溫下 190000 g 離心 1 h。
( 5 ) 定量分析上清液和沉淀中的蛋白質，獲得增溶產量。
( 6 ) 在 SDS-PAGE 上分析溶解蛋白質（上清液）和不溶解蛋白質（沉淀）的條帶。
經過這些步驟可獲得與初始 PM 蛋白質很相似的溶解蛋白質的 SDS-PAGE 圖譜 ( 圖 22-2)，約有 85% 的初始蛋白質可經上述實驗過程溶解出來。
3.3 色譜層析
1. IEC/SDS-PAGE 分離
使用 Mono Q HR 5/5 層析柱（Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）進行陰離子交換色譜層析（A EC，見注釋 3) ，在整個層析過程中，用 280 nm 吸收監測蛋白質洗脫，并設定組分收集容積為 0.3 ml。樣品和洗脫緩沖液中的去垢劑容易在管道系統中形成泡泡，因此，建議小心超聲處理（30 min ) 緩沖液和調整洗脫速度（0.5~1 ml/min) 。
( 1 ) 室溫下，用 15 ml 洗脫緩沖液平衡層析柱。
( 2 ) 將新增溶出來的蛋白質（0.5~2 mg 蛋白質，2 ml 溶液）上樣到層析柱上，當收集組分時，用 5 ml 洗脫緩沖液沖洗柱子。
( 3 ) 用 10~15 ml 線性鹽梯度（在洗脫緩沖液中含 0~1 mol/L NaCl 鹽濃度）洗脫蛋白質。
( 4 ) 用 5 ml 含有 1 mol/L NaCl 的洗脫緩沖液沖洗柱子，將柱子里的殘留樣品洗出。
( 5 ) 在收集的組分中加入冷丙酮 [ -20°C，80% ( V/V) ] ，于 -20°C 下過夜，用以沉淀蛋白質。
( 6 ) 用微量離心機 4°C 條件下 17000 g 離心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白質樣品中加入 50 μl 的 Laemmli 樣品緩沖液，渦旋振蕩，并超聲波振蕩處理（超聲波水浴中處理 15 min) ，重懸沉淀的蛋白質。
( 8 ) 用 SDS-PAGE 分離蛋白質條帶。
具代表性的 IEC/SDS-PAGE 分離方法（從 0.5 mg 酵母質膜增溶出來的蛋白質幵始）見圖 22-3A。我們可以看到 3~6 個連續收集的組分中都含有同一條帶，用 MALDI-TOF/MS 可以從 70% 的電泳條帶中鑒定出一個蛋白質，從 5%~25% 的條帶中鑒定 2 個或 3 個蛋白質（圖 22-3B) 。比較連續排列的不同處理的同梯度洗脫下來的陰離子交換層析（AEC ) 組分的 SDS-PAGE 泳道來進行數據分析。
2. GFC/AEC/SDS-PAGE Separation
分離復雜的蛋白質混合物，如膜粗提物，需要兩個連續的色譜層析步驟。因此，必須獲得較大量（約 5 mg) 的增溶蛋白質樣品。這也有利于低豐度的蛋白質在 SDS-PAGE 電泳泳道上被分辨出來。由于分子篩色譜層析（GFC) 會稀釋樣品，因此它被用在第一步的色譜層析，經 GFC 層析后被稀釋的樣品經第二步的離子交換層析（IEC ) 后得到濃縮。下面介紹的是，擬南芥膜增溶蛋白用 Superdex 200 Highload 16/60 層析柱進行的 GFC 色譜層析實驗（見注釋 5) 。
( 1 ) 用 180 ml 洗脫緩沖液，1 ml/min 流速，室溫下平衡 GFC 層析柱。
( 2 ) 將新增溶的蛋白質樣品進樣到層析柱上。
( 3 ) 用 180 ml 洗脫緩沖液洗脫蛋白（0.5 ml/min) ，并設置 0.3 ml 的收集組分容積。
( 4 ) 將鄰近組分中蛋白質含量低于 500 μg ( 根據 280 nm 吸收估計的量）的組分合并在一起（見注釋 6) 。
( 5 ) 取 100 μg GFC 分離組分樣品，加入冷丙酮 [ -20°C，80% (V/V)] ，于 -20°C 下過夜，用以沉淀蛋白質。
( 6 ) 用微量離心機 4°C 下 17000 g 離心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白質樣品中加入 50 μl Laemmli 樣品緩沖液，渦旋振蕩，并超聲波振蕩處理（超聲波水浴中處理 15 min) ，重懸沉淀的蛋白質。
( 8 ) 按前述方法用 SDS-PAGE 分離 GFC 洗脫組分的蛋白質。
( 9 ) 按前述方法將上述的 GFC 分離出來的組分樣品（至少含 500 μg 的蛋白質）進行第二步 AEC 色譜層析，使用 Mono Q HR 5/5 ( Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）。
膜粗提物經 GFC/SDS-PAGE 分離后，得到較為復雜的蛋白圖譜，特別是在 40~70 kDa 區域內（圖 22-4)。當經過 GFC/AEC/SDSPAGE 分離后，可得到較為簡單的蛋白質圖譜（圖 22-5)，易于用 MALDI-TOF/MS 鑒定蛋白質（切下的蛋白質條帶含較少的蛋白質)。
3.4 胰蛋白酶膠內蛋白消化
( 1 ) 切下考馬斯亮藍染色的條帶。
( 2 ) 用 2 ml ( 在 2 ml 離心管中）洗膠液充分沖洗切下來的膠粒至完全褪色，一般來說，兩次 4 h 的脫色沖洗可完全脫去膠粒的顏色。
( 3 ) 將褪色的膠粒在純乙腈溶液中脫水處理 1 h。
( 4 ) 用真空干燥器完全干燥膠粒（30 min)。
( 5 ) 4°C 條件下，用消化緩沖液制備新鮮的胰蛋白酶溶液（0.02 μg/μl)，防止酶的自身消化，置冰上備用。
( 6 ) 將干燥的膠粒置于小離心管中，滴入 15 μl 的胰蛋白酶溶液，將管子插入冰中，水化膠粒。30 min 后，膠粒上只有薄薄的一層胰蛋白酶溶液。當初始加入的胰蛋白酶液滴被膠粒完全吸收后，加入 15 mmol/L 碳酸氫銨緩沖液，使膠粒周圍包裹一層薄薄的碳酸氫銨。如果初始加入的胰蛋白酶溶液未被膠粒完全吸收，吸出多余的胰蛋白酶溶液，使膠粒周圍只有一層薄薄的胰蛋白酶（見注釋 7) 。
( 7 ) 將裝有膠粒的離心管封口，37°C 至少保溫 5 h，也可保溫過夜。
( 8 ) 加入 150 μl 肽段萃取緩沖液，20°C 保溫 3 h。
( 9 ) 去掉膠粒，用真空干燥器將 500 μl 離心管中的肽段萃取液濃縮至 5 μl。千萬不要將肽段萃取液完全干燥，因為那樣會使肽段吸附在管壁上而洗不下來。
3.5 MALDI-TOF/MS
在本書介紹的通用步驟（見第 19 章）之后，蛋白質將在靶上結晶，這里簡單闡述如下：
( 1 ) 用半飽和的 1:1 乙腈/水溶液新鮮配制 α-氰基-4-羥基肉桂酸，并用 0.1% TFA 酸化。
( 2 ) 將 0.8 μl 的蛋白質樣品與 0.8 μl 的基質混合，并立即點樣到靶上。
( 3 ) 讓樣品在靶上干燥和結晶。
( 4 ) 用超純水沖洗靶后，讓其干燥。
當譜圖穩定后，讀取譜圖（200~300 次激光轟擊，見注釋 8)。
3.6 數據庫檢索
現在有許多不同的搜索引擎可以用來鑒定已獲得肽質量的蛋白質，ProFound [10] 能夠很好地用來進行蛋白質混合樣品（最多可達 4 種蛋白質）的鑒定。在我們的分析中，總是假設為混合樣品（雖然也會出現最終的鑒定結果表示只有一種蛋白質)。檢索所用的參數如下：合適的物種分類范疇（擬南芥或釀酒酵母）；質量誤差為 0.1 Da ( 允許肽段質量偏離校準范圍的最大值 )；允許 1 個酶切缺失位點；蛋白質分子質量范圍：0~1000 kDa；pI 范圍：0~14；氨基酸未被化學修飾。考慮到混合物中可能存在的蛋白質種類的數量，可以進行最多 4 次改變可能的蛋白質的數量設置（最大設置為 4)。存取檢索運行中獲得的最高分值的結果。對于每個鑒定的蛋白質，實驗匹配質量用在最終的 ProFound “ 單個蛋白質” 檢索。最后，那些可能性接近 1，且 Z 分值高于 1.65 的蛋白質才予以考慮。 展 | 
